このプロトコルは、非専門家による自己再タンパク質合成を実施する方法を簡素化し、明確にします。これらのメソッドへのアクセスを改善すると、プラットフォームと、それが可能になる広範なアプリケーションのセットをデマーケット化するのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の自己再タンパク質合成プラットフォームと比較して、速度、費用対効果、および反応の容易さです。
当社のプラットフォームは、機能ゲノミクス、ハイトホープ試験、バイオセンサー、教育キット、マイナーな変更、代謝工学、遺伝子コードの拡張など、多くのアプリケーションを可能にします。このテクニックは基本的な実験室でのトレーニングを必要としますが、新しいユーザーはプロトコルの実行を成功させるために超音波処理のような技術に慣れる計画を立てる必要があります。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明したとおりに、すべてのメディアおよびカルチャの大腸菌セルを準備します。
1リットルの遠心分離機ボトルを氷水浴に入れます。培養OD600が3.0に達したら、細胞培養液を冷蔵ボトルに注ぎます。ダブルビームバランスを使用して、2番目の1リットルの遠心分離機ボトルに水を加え、最初と同じ重さを計り、遠心分離機のバランスを作ります。
遠心分離機を摂氏4度に予感させた後、ボトルを5,000g、摂氏10度で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。この後、ゆっくりと注ぎ、上清を処分します。細胞ペレットを氷の上に置きます。
無菌ヘラを使用して遠心分離器ボトルから細胞ペレットを掻き取り、冷たい50ミリリットルの円錐形チューブに移します。2ミリモルDTTを補った冷たいS30バッファーの30ミリリットルを加え、ペレットがチャンクなしで完全に再懸濁されるまで氷上の休息期間で短いバーストでペレットを再中断します。この後、水で満たされた別の50ミリメートルの円錐管をバランスとして使用し、サンプルを5、000g、摂氏10度で10分間遠心します。
上清を注ぎ出して処分します。ペレットを20~25ミリリットルの冷たいS30バッファーで再懸濁します。5,000 gで遠心分離機、摂氏10度で10分間。
上清を注ぎ出して処分します。次に、30ミリリットルのS30バッファーを加え、前述のように渦を使用してペレットを再懸濁する。3つの事前計量、冷たい、50ミリリットルの円錐管を設定します。
生殖管ピペットを含む血清ピペットフィラーを使用し、各チューブに10ミリリットルのペレット懸濁液をアリコートした。5,000 gおよび10°Cで必要に応じて適切なバランスを使用して、すべてのチューブを10分間遠心分離します。この後、上清を注ぎ出して処分します。
各チューブとキャップの内側を清潔なティッシュで慎重に拭き取り、アクセスバッファを取り除き、ペレットに触れないようにします。分析バランスを使用して、チューブを再計量し、各チューブの最終的なペレット重量を報告します。まず、各ペレットに細胞質量1グラムあたり2ミリモルDTTを有する冷たいS30バッファーを1ミリリットル加える。
前述のように、渦を使用してペレットを再中断します。次に、各再懸濁されたペレットの1.4ミリリットルを別々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。ビーカーの氷水浴にチューブを1つ置き、チューブの底部や側面に触れないようにソニケータープローブを配置します。
振幅を50%に設定して45秒間、続いて59秒間の休息を取ります。オフ期間中にチューブを閉じて反転することを確認します。超音波処理が完了した直後に、1つのモルDTTの4.5マイクロリットルをlysateに加えます。
チューブを数回反転して混ぜ、氷の上に置きます。再懸濁細胞の各チューブのDTTを超音波処理し、追加し、このプロセスを繰り返します。サンプルを18,000g、摂氏4度で10分間遠心分離します。
この後、ピペット各上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、ペレットが乱れないように上澄み物を残します。上清のチューブをインキュベーターの揺れプラットフォームに持ち込み、250 RPMで60分間振ると摂氏37度でインキュベートします。これは流出反応です。
その後、サンプルを10,000gで、摂氏4度で10分間遠心します。ペレットを邪魔することなく、新しいチューブに移す各上清を除去します。貯蔵のための抽出物の多くの100マイクロリットルのアリコートを作成する。
まず、融解液A、溶液B、DNAテンプレート、BL21DE3抽出物、T7 RNAポリメラーゼ、および氷上の分子グレード水のアリコートを含む。次に、CFPS反応に必要なマイクロ遠心チューブの必要量をラベル付けします。各試薬をピペッティングまたはボルテックスで混合し、その後、標識された反応管に溶液を加え、細胞抽出物をボルテックスせず、代わりにチューブを反転して混合するようにします。
最終的な反応が十分に混合されていることを確認し、各チューブの底部に15マイクロリットルビーズに組み合わせます。摂氏37度で4時間、または一晩で摂氏30度で振ることなく、各反応をインキュベートします。まず、96ウェルプレートを取得し、定量に必要な各ウェルにpH 8で0.05モルHEPESの48マイクロリットルをロードします。
次に、インキュベーターから反応管を取り除きます。各反応を上下にピペットして混合し、各反応の2マイクロリットルをHEPESを含むウェルに移します。上下にピペットを入れ、それぞれをよく混ぜます。
すべての反応をロードして混合した後、プレートをフルオロメーターにロードし、励起波長485ナノメートルと発光波長510ナノメートルを使用してSFGFPエンドポイント蛍光を測定します。以前に生成された標準曲線を使用して、得られた蛍光読み取りからスーパーフォルダ化されたGFPの濃度を決定します。本研究では、超音波処理ベースの大腸菌抽出物調製物を調査する。
細胞ペレットおよび細胞抽出物は、少なくとも1年間は80°Cの負の摂氏で安定している。さらに、細胞抽出物は、生産性を著しく損なうことなく、少なくとも5回の凍結融解サイクルを経ることができる。このプロトコル内の一部のステップは、システムの全体的な生産性に悪影響を及ばすことなく変更できます。
最も顕著なのは、細胞抽出物生産性に大きな影響を与えることなく、600ナノメートルで2.7〜4.0光密度の範囲内で細胞を収穫することができる。しかし、テンプレートDNAの品質は、CFPS反応の体積収量に影響を与えるバッチ間変動の源です。これは、ミディまたはマキシププレップを介してDNAを精製し、続いて追加のDNAクリーンアップステップを行うことによって解決されます。
反応容器はまたCFPSの反作用の容積物の収量に影響を与える。表面積対体積比の増加は、より高い体積収率をもたらします。CFPS反応の体積量を最適化し、バッチからバッチへの細胞抽出量を低減するために、新しい抽出物の調製ごとにマグネシウム滴定を行う必要があります。
1ミリリットルの総タンパク質当たり30ミリグラムからなる細胞抽出物の場合、試薬の使用量を最小限に抑え、体積収率を最大化するための最適なマグネシウム濃度と抽出量はそれぞれ10ミリモルおよび5マイクロリットルです。反応スケールを変えることで、ハイスループットスクリーニングから標的タンパク質の大規模な表現まで幅広い方法を追求できます。この技術は2つの重要な利点を提供し、まずタンパク質産物をより迅速にスクリーンし、第2に、タンパク質を発現することが困難な合成を提供する。
例としては、細胞毒性を持つタンパク質、またはそれらの機能に対する酸化条件を必要とするタンパク質が含まれます。他の実験室の手順と同様に、すべての試薬は慎重に扱われるべきです。さらに、遠心分離機は常にバランスをとり、耳の保護は超音波処理中に使用する必要があります。
