الهدف العام لهذا الإجراء هو توفير طريقة لتقييم نشاط كيناز LRRK2 الذاتية في الدم المحيطي البشري. ويتحقق ذلك من خلال رصد الفوسفور بوساطة LRRK2 من بروتينات راب، وتوظيف مايكل ج. فوكس مؤسسة فوسفو محددة الأجسام المضادة أحادية النسيلة الرب. هنا، ونحن نركز على العدلات الدم المحيطية الإنسان باعتبارها تشكل سكان الموقع متجانسة مع مستويات التعبير عالية من كل من Rab2 و Rab10.
ويستند عزل العدلات على اختيار السلبية التي في غضون 40 دقيقة من العمل النهائي يسمح العزلة من 99٪ العدلات النقية والقابلة للحياة في حين تسفر أيضا عن كمية عالية من مستويات البروتين. جمع 10 ملليلتر من الدم في أنبوب جمع الدم. مزيج بلطف عن طريق عكس الأنابيب من سبع إلى ثماني مرات.
نقل 10 ملليلتر من الدم إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. إضافة إلى الدم 100 ميكرولترات من EDTA الأسهم الحل 1، 0.1 الضرس EDTA برنامج تلفزيوني الحل، مزيج بلطف. أضف 500 كوكتيل عزل ميكرولتر، 50 ميكرولترتر لكل ملليلتر من طقم عزل العدلات إلى عينة الدم بأكملها.
دوامة الخرز المغناطيسي من العدة العزل العدلات لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام من أجل resuspend الخرز المغناطيسي غرامة جدا. إضافة 500 الخرز ميكرولترس المغناطيسي إلى عينة الدم ومزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
أعلى أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر مع EDTA حل الأسهم 2. هذا هو ميل ملليمولار EDTA PBS. مزيج من قبل pipetting بلطف جدا صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات.
ضع الأنبوب في المغناطيس وأزل الغطاء لتجنب التحريض اللاحق للأنبوب. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعناية ماصة المخصب تعليق الخلية التي تحتوي على العدلات في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر.
لا تلمس جانب الأنبوب الذي يتم ملامسته للمغناطيس وتجنب جمع وانزعاج خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. اترك حوالي 10 ملليلترات من تعليق خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. Vortex الخرز المغناطيسي لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام وإضافة 0.5 ملليلتر الخرز المغناطيسي إلى أنبوب يحتوي على العدلات المخصب.
تخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع الأنبوب في المغناطيس وأزل الغطاء لتجنب الانفعالات اللاحقة.
احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماص بعناية تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي على العدلات في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس.
اترك ما يقرب من خمسة ملليلتر من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب. لضمان الإزالة الكاملة للخرز المغناطيسي من خليط الخلايا، ضع أنبوب يحتوي على الخلايا المخصبة في المغناطيس. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
الماص بعناية تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي الآن على العدلات النقية في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس. اترك ما يقرب من خمسة ملليلتر من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب.
أعلى الخلايا المعزولة مع واحد ملليمتر EDTA حل الأسهم 2 إلى حجم النهائي من 41 ملليلتر تقريبا. الماصة صعودا وهبوطا لخلط. تقسيم الحل بالتساوي إلى أنبوبين مع ما يقرب من 20 ملليلتر في كل أنبوب.
جهاز طرد مركزي كلا الأنابيب في 335G لمدة خمس دقائق. أثناء خطوة الطرد المركزي، واتخاذ MLi-2 مخزون مثبطات، 200 قطع micromolar 1000X تركيز من ناقص 80 درجة الفريزر وترك في درجة حرارة الغرفة للاستخدام اللاحقة. مباشرة بعد خطوة الطرد المركزي ودون التحريض من الأنابيب، صب قبالة سوبرنات دون إزعاج الكريات العدلات.
resuspend كل بيليه خلية في 10 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة في درجة حرارة الغرفة عن طريق الأنابيب بلطف الخلايا صعودا وهبوطا أربع مرات. تسمية أنبوب واحد DMSO والآخر أنبوب MLi-2. إلى DMSO المسمى أنبوب إضافة 10 ميكرولتر من DMSO وإضافة 10 microliters من 200 ميكرومولار MLi-2 حل الأسهم عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا لخلط.
احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلط بلطف عن طريق عكس كل 10 دقائق خلال فترة الحضانة. خلال 30 دقيقة LRRK2 kinase علاج مثبطات إزالة 0.5 مول DIFP حل الأسهم من الفريزر درجة ناقص 80 ومكان في غطاء الدخان على الجليد.
ثم، نقل مليغرام واحد لكل ملليلتر Microcystin-LR حل الأسهم من الفريزر ناقص 80 درجة ومكان في درجة حرارة الغرفة للذوبان. إزالة الجليد aliquot ، 0.25 ملليلتر من العازلة تحلل عن طريق إخراجه من الثلاجة ، والسماح لتذويب الجليد في درجة حرارة الغرفة ومن ثم وضعه على الجليد للاستخدام اللاحقة. إعداد ملليلتر واحد من المتوسط RPMI التي تحتوي على ميكرولتر واحد من DMSO استدعاء هذا DMSO Resuspension العازلة.
إعداد ملليلتر واحد من المتوسط RPMI تحتوي على ميكرولتر واحد من 200 MLi-2 ميكرومولار أو بديل مثبط LRRK2 كيناز ودعوة هذا MLi-2 Resuspension العازلة. بعد فترة الحضانة 30 دقيقة، الطرد المركزي كلا الأنابيب في 335G لمدة خمس دقائق، كما كان من قبل. تجاهل بعناية في افرانت في كل أنبوب دون إزعاج بيليه العدلات.
بالنسبة للأنبوب المسمى DMSO، بيليه إعادة الاعتماد بلطف في ملليلتر واحد من DMSO Resuspension العازلة. وبالنسبة للأنبوب MLi-2 المسمى ، فإن بيليه ريسوسيبيند في ملليلتر واحدة من MLi-2 Resuspension Buffer. نقل الكريات الخلية التي أعيد اعتمادها إلى أنابيب الطرد المركزي المقابلة المسماة DMSO وMLi-2 والطرد المركزي على 335G لمدة ثلاث دقائق.
أثناء خطوة الطرد المركزي، قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل. في غطاء الدخان، إضافة بعناية 0.25 ميكرولترات من 0.5 مولار DIFP الحل، فضلا عن 0.25 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر microcystin-LR إلى 0.25 ملليلتر تحلل العازلة. تخلط وتترك على الجليد حتى الاستخدام.
مباشرة بعد الطرد المركزي، بعناية وبشكل كامل إزالة جميع مغرور مع ماصة دون إزعاج بيليه العدلات ووضع أنابيب على الجليد. إضافة على الفور 100 ميكرولترات من عازلة تحلل تحتوي على DIFP وmicrocystin-LR إلى كل أنبوب. باستخدام ماصة 100 إلى 200 ميكروليتر، resuspend الكريات الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حوالي خمس إلى 10 مرات.
الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم أنابيب الطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. نقل DMSO وMLi-2 supernatant التي تحتوي على العدلات lysates في أنابيب الطرد المركزي الجديدة.
تخلص من الكريات الحطامية. العدلات هي الآن جاهزة للاستخدام أو يمكن أن المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 80 درجة للتحليل في المستقبل. باستخدام البيانات من قاعدة بيانات الاستيراد المتاحة للجمهور، وهذا الرسم البياني يظهر أن وفرة من البروتينات LRRK2 و Rab10 عالية بشكل خاص في العدلات الدم الطرفية البشرية والموحدات.
عزل العدلات الدم الطرفية البشرية مع هذا الإجراء يؤدي إلى ارتفاع العائد نجس من الخلايا. الجدول في الجزء العلوي يظهر العدد الإجمالي للخلايا المعزولة من 10 ملليلتر من الدم المحيطي من ثلاثة متبرعين أصحاء. كما تبين نقاء وديموة الخلايا المعزولة، فضلا عن غلة البروتين lysate الكلي.
بعد العلاج مع وبدون مثبطات LRRK2 كيناز، MLi-2، يتم lysed العدلات في وجود مثبطات البروتياز قوية، DIFP. بالنسبة إلى الشكل B على الجانب الأيسر، خضعت 10 ميكروغرام من مستخلصات الخلايا الكاملة لكل حارة لتحليل مناعة كمية متعددة مع الأجسام المضادة المشار إليها. ويوضح الشكل على اليمين، C، أهمية DIFP للوقاية من التحلل البروتيني، ولا سيما بروتين LRRK2 الكبير.
وبالمقارنة، فإن التركيزات العالية من الـ PMSF وحدها أقل فعالية. هنا هو مبين أن LRRK2 التي تسيطر عليها Rab10 الفوسفورية زيادة كبيرة بنحو ثلاثة أضعاف في العدلات الدم الطرفية المستمدة من المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون وراثية إيواء الطفرة VPS35 D620N بالمقارنة مع الضوابط. الرسم البياني العلوي يبين تحليل مناعة متعددة والقاع ، ومقدارها.
وهذا يشير إلى أن طفرة VPS35 D620N ينشط مسار LRRK2 كيناز من النشاط من قبل آلية غير معروفة حتى الآن. باختصار، نقدم مقايسة سهلة وقوية لقياس نشاط مسار LRRK2 كيناز من خلال مراقبة فوسفيجيلة بروتين راب، مثل Rab10، في العدلات المشتقة من الطرفية البشرية، وهذه الطريقة تسمح لنا بتقييم نشاط مسار LRRK2 وتحديد كيفية الطفرات، أو حالات المرض أو مثبطات تعدل نشاط مسار LRRK2.
