هذه الطريقة تساعد على مقارنة النشاط السام للخلايا من أنواع الخلايا المختلفة باستخدام طريقة بسيطة وغير مكلفة لا تتطلب معدات متخصصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام مواد خطرة ، فهي غير مكلفة ، ولا تتطلب استخدام معدات متخصصة. يمكن تطبيق هذه الطريقة لقياس النشاط السام للخلايا من أنواع الخلايا الأخرى مثل CD8 بالإضافة إلى الخلايا الخلوية أو حتى لتقييم الموت التلقائي للخلايا دون احتضان، دون الخلايا المؤثرة الخلوية.
الأفراد الجدد لهذه التقنية سوف النضال على الأرجح مع تحسين الهدف إلى نسبة الخلايا effector. نصيحتي هي القيام ببحث شامل من الأدب لتحديد النسب التي كنت اختبار عند تحسين البروتوكول. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تتطلب مهارات متخصصة، بخلاف الأنابيب بدقة، فإن عزل الخلايا أحادية النواة وإعداد لوحة المقايسة هما خطوتان يمكن فهمهما ومحاكاتهما بسهولة أكبر إذا تمت ملاحظتهن بصرياً.
إثبات الإجراء سيكون تشيلسي جيكلي، فني من مختبري. لبدء هذا الإجراء، إضافة 13.5 ملليلتر من RPMI في 1.5 ملليلتر من FBS إلى طبق بيتري التي تحتوي على مرشح 100 ميكرومتر. ضع مشيمة واحدة على الفلتر واستخدم الجانب المسطح من المكبس المحاقن لدفعها من خلال الفلتر وإلى طبق بيتري.
بعد ذلك، وضعت ثلاثة أنابيب مخروطية 15 ملليلتر لكل نسيج. إضافة ثلاثة ملليلترات من متوسطة الكثافة التدرج لكل أنبوب، وتراكب ببطء خمسة ملليلتر من المشيمة المتجانسة في كل أنبوب. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة مع عدم وجود استراحة.
ثم، استخدام ماصة نقل لجمع طبقة رقيقة بافي أبيض. إضافة 10 ملليلتر من RPMI إلى طبقات بافي مجتمعة. أجهزة الطرد المركزي في 300 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق والتخلص من فائقة.
أولاً، إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني بارد الجليد. إضافة الأجسام المضادة CD3 المسمى البيوتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وخلط جيدا مع ماصة. ضع الأنبوب في دوار أنبوب وحضن في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من RPMI. جهاز طرد مركزي في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل افرا وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من RPMI.
الجمع بين تعليق الخلية مع 150 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر. نقل أنبوب إلى أنبوب الدوار وتدوير في حين احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة، واسترداد العازلة الإفراج والسماح لها الوصول إلى درجة حرارة الغرفة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
بعد اكتمال الحضانة، ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. جمع عظمى وحفظ السكان الخلايا السلبية CD3 في أنبوب 15 ملليلتر على الجليد. إزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة ملليلتر واحد من دورة في الدقيقة واستخدام ماصة لخلط الخلايا والخرز خمس مرات.
ثم، ضع الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. جمع افرا وحفظ السكان CD3 السلبية في أنبوب 15 ملليلتر على الجليد. أجهزة الطرد المركزي السكان السلبية CD3 من الخلايا في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل الماثرة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولترات من PBS الجليد الباردة. بعد ذلك، إضافة البيوتين المسمى CD161A الأجسام المضادة للخلايا السلبية CD3، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ومزيج جيد. ضع الأنبوب في دوار أنبوب واحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك، يضاف ملليلتر واحد من RPMI والطرد المركزي في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من RPMI والجمع بين ذلك مع الخرز المغناطيسي في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. ضع الأنبوب في دوار أنبوب وتناوب أثناء الاحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم، ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. جمع فائقة وتجاهل CD3 السلبية CD161A الخلايا السلبية. إزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة ملليلتر واحد من RPMI واخلط جيدا.
وضع أنبوب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة، مع التأكد من جمع عظمى وتجاهل الخلايا السلبية CD3 CD161A السلبية. بعد ذلك، إزالة الأنبوب من المغناطيس وإضافة ملليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة العازلة. ضع الأنبوب على دوار أنبوب وتناوب أثناء احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. جمع المافق في أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر على الجليد. إزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة ملليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة RPMI ويخلط جيدا.
وضع أنبوب مرة أخرى تحت المغناطيس لمدة دقيقة واحدة، مع التأكد من جمع افر في نفس أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. تخلط جيدا وتأخذ عينة 20 ميكرولتر لحساب الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
قم بإزالة المُنَاط و إعادة تعليق الخلايا في RPMI. بذور الخلايا في لوحة ستة جيدا في تركيز 300،000 الخلايا في بئر في 2.5 ملليلتر من NK خلية تنشيط وسائل الإعلام. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة.
في غطاء محرك السيارة، استخدم ماصة مصلية لنقل خلايا YAC1 في الوسائط إلى أنبوب 50 ملليلتر على الجليد واخلط جيداً. خذ 20 ميكروليتر aliquot لحساب الخلايا. تدور الخلايا في 300 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
باستخدام ماصة المصلية، وجمع افرا من خلية NK المعدة مسبقا ستة لوحة بئر في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. ثم، إضافة التربسين EDTA إلى كل بئر. اضغط على اللوحة ووضعها في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
بعد أن تحضن الخلايا مع التربسين EDTA لمدة خمس دقائق تقريبا، واستخدام مكشطة لوحة العقيمة لكشط لوحة. ثم إضافة ملليلتر واحد من وسائط الخلايا NK إلى كل بئر. باستخدام ماصة المصلية، وجمع الخلايا والوسائط ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
خذ 20 ميكروليتر aliquot لحساب الخلايا. أجهزة الطرد المركزي خلايا NK في 400 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. أولاً، الحصول على قاع دائري، معالجة الثقافة 96 لوحة جيداً وإعداده على النحو المبين في الجدول الأول من بروتوكول النص.
الطرد المركزي لوحة المقايسة في 250 مرة G لمدة أربع دقائق للتأكد من أن أثر والخلايا المستهدفة هي في اتصال. بعد ذلك، احتضان لوحة في غرفة مرطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. 45 دقيقة قبل الحصاد ابر، إضافة 10 ميكرولترات من 10X محلول تحلل إلى الخلية المستهدفة LDH الإفراج عن الآبار والعودة إلى لوحة غرفة مرطب.
عندما اكتمال الحضانة، الطرد المركزي لوحة في 250 مرات G لمدة أربع دقائق، ثم استخدام أنبوب متعدد القنوات لنقل 50 aliliter 50 من كل بئر إلى 96-well جديدة، لوحة المقايسة أسفل مسطحة. إضافة 50 microliters من الكاشف المقايسة إلى كل بئر من لوحة المقايسة. غطي الطبق بطبقة تحميه من الضوء ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من وقف الحل لكل بئر. تأكد من قراءة اللوحة في غضون ساعة واحدة من إضافة حل التوقف وتسجيل الامتصاص في 490 نانومتر. يتم احتضان خلايا NK المشيمة التي تم الحصول عليها من NP وRUPP الفئران لمدة خمس ساعات مع الخلايا المستهدفة في وسائل الإعلام الخاصة بهم بنسبة 50:1.
وتظهر هنا بيانات الامتصاص الخام المسجلة في 490 نانومتر. ويُحسب متوسط امتصاص الخلفية الثقافية المتوسطة وآبار التحكم في تصحيح الحجم، وتطرح هذه المتوسطات من الآبار المناسبة المشار إليها في بروتوكول الشركة المصنعة. ثم يتم استخدام القيم المصححة للحصول على السمية الخلوية باستخدام البروتوكول المقدم من قبل الشركة المصنعة.
على الرغم من أن هذه الطريقة لا تتطلب مهارات متخصصة، بخلاف الأنابيب بدقة، فإن عزل الخلايا أحادية النواة وإعداد لوحة المقايسة هما خطوتان يمكن فهمهما ومحاكاتهما بسهولة أكبر إذا تمت ملاحظتهن بصرياً. بعد عزل خلايا NK، يمكن تنفيذ عدد من الإجراءات الأخرى، مثل تجارب الثقافة المشتركة لتحديد دور خلايا NK المشيمة في عزوها إلى الهجرة الأرومية خلال فترة الحمل. نحن أيضا جمع وسائل الإعلام من خلايا NK الموسعة لتقييم السيتوكيناز يفرز من الخلايا المحفزة تفاضليا.
ويمكن أيضا أن نقاء الخلايا المعزولة يمكن تقييمها عن طريق تدفق القياسات.
