Bu yöntem, özel ekipman gerektirmeyen basit, ucuz bir yöntem kullanarak farklı hücre türlerinin sitotoksik aktivitesini karşılaştırmaya yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı tehlikeli maddelerin kullanımını gerektirmemesi, ucuz olması ve özel ekipman kullanımını gerektirmemesidir. Bu yöntem CD8 artı sitolitik hücreler gibi diğer hücre tiplerinin sitotoksik aktivitesini ölçmek ve hatta sitolitik efektör hücreler olmadan, kuluçka olmadan hücrelerin spontan ölümünü değerlendirmek için uygulanabilir.
Bu teknikyeni bireyler büyük olasılıkla etkiveya hücre oranı hedef optimizasyonu ile mücadele edecektir. Benim tavsiyem, protokolü optimize ederken test edeceğiniz oranları belirlemek için literatürde kapsamlı bir arama yapmanızdır. Bu yöntem, doğru pipetleme dışında özel beceriler gerektirmese de, mononükleer hücrelerin izolasyonu ve elektasyon plakasının kurulumu, görsel olarak gözlenirse daha kolay anlaşılabilecek ve taklit edilebilen adımlardır.
Prosedürü gösteren Chelsea Jekelley, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, 100 mikrometre filtre içeren bir Petri kabına 1,5 mililitre FBS'ye 13,5 mililitre RPMI ekleyin. Filtreye bir plasenta yerleştirin ve bir şırınga pistonunun düz tarafını kullanarak filtreden geçip Petri kabına doğru itin.
Sonra, her doku için üç adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin. Her tüpe üç mililitre yoğunluk gradyan ortam ekleyin ve her tüpe beş mililitre homojenize plasentayı yavaşça bökezle. 300 kez G ve oda sıcaklığında 25 dakika boyunca hiçbir mola ile santrifüj.
Daha sonra, ince beyaz buffy tabaka toplamak için bir transfer pipet kullanın. Kombine buffy katmanlarına 10 mililitre RPMI ekleyin. Santrifüj 300 kez G ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat ve supernatant atın.
İlk olarak, 50 mikrolitre buz gibi PBS'de hücre peletini yeniden askıya alın. Üreticinin protokolüne göre biotin etiketli CD3 antikor ekleyin ve bir pipet ile iyice karıştırın. Tüpü bir tüp rotatörüne yerleştirin ve 20 dakika boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın.
Sonra, RPMI bir mililitre ekleyin. 400 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj. Supernatant atın ve RPMI bir mililitre pelet yeniden askıya.
Hücre süspansiyonu ile 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpte 150 mikrolitre manyetik boncuk birleştirin. Tüpü bir tüp rotator'a aktarın ve 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatarken döndürün. Kuluçka sırasında, serbest tampon almak ve bir biyo güvenlik kabininde oda sıcaklığına ulaşmasını sağlar.
Kuluçka tamamlandıktan sonra, bir dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Supernatant toplamak ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüp HALINDE CD3 negatif hücre popülasyonu kaydedin. Mıknatıstan tüp çıkarın, RPMI bir mililitre ekleyin ve hücreleri ve boncukları beş kez karıştırmak için bir pipet kullanın.
Sonra, bir dakika için mıknatıs içine tüp geri yerleştirin. Supernatant toplamak ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüp IÇINDE CD3 negatif nüfus kaydedin. Cd3 negatif hücre popülasyonunu 400 kez G'de ve 4 derece santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve buz gibi PBS 50 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya. Bundan sonra, üreticinin talimatlarına göre, CD3 negatif hücrelere biotin etiketli CD161A antikor ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü bir tüp rotatörüne yerleştirin ve 20 dakika boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, 400 kez G ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat bir mililitre RPMI ve santrifüj ekleyin. Supernatant atın ve rpmi bir mililitre pelet yeniden askıya ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp manyetik boncuk ile birleştirmek. Tüpü tüp rotatörüne yerleştirin ve 4 derecede kuluçkaya yatarken 30 dakika döndürün.
Sonra, bir dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Supernatant toplamak ve CD3 negatif CD161A negatif hücreleri atın. Mıknatıstan tüp çıkarın, RPMI bir mililitre ekleyin ve iyice karıştırın.
Bir dakika için mıknatıs tüp yerleştirin, supernatant toplamak ve CD3 negatif CD161A negatif hücreleri atmak emin olun. Bundan sonra, mıknatıs tüp çıkarın ve oda sıcaklığında serbest tampon bir mililitre ekleyin. Tüpü bir tüp rotator'a yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatarken döndürün.
Sonra, bir dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Buz üzerinde yeni bir 15 mililitrelik konik tüp supernatant toplamak. Mıknatıstan tüp çıkarın, oda sıcaklığında RPMI bir mililitre ekleyin ve iyice karıştırın.
Aynı 15 mililitrelik konik tüp içinde supernatant toplamak için emin olun, bir dakika için mıknatıs altında tüp geri yerleştirin. İyi bir şekilde karıştırın ve hücreleri saymak için 20 mikrolitrelik bir örnek alın. Hücreleri 400 kez G'de ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve RPMI hücreleri yeniden askıya. NK hücre aktivasyon ortamının 2,5 mililitre de iyi başına 300, 000 hücre konsantrasyonu altı kuyu plaka içine hücreleri tohum. 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksit le 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bir başlık, buz üzerinde 50 mililitrelik tüp medyada YAC1 hücreleri aktarmak ve iyi karıştırmak için bir serolojik pipet kullanın. Hücreleri saymak için 20 mikrolitrelik bir aliquot alın. Hücreleri 300 kez G'de ve 4 santigrat derecede 10 dakika döndürün.
Serolojik pipet kullanarak, 15 mililitre konik tüp içinde daha önce hazırlanmış NK hücre altı iyi plaka supernatant toplamak. Sonra, her iyi trypsin EDTA ekleyin. Tabağa dokunun ve 37 santigrat derecede bir kuvöze yerleştirin.
Hücreler yaklaşık beş dakika tripsin EDTA ile kuluçkaya yattıktan sonra, tabağı kazımak için steril bir plaka kazıyıcı kullanın. Sonra her kuyuya bir mililitre NK hücreli ortam ekleyin. Serolojik pipet kullanarak, hücreleri ve medya toplamak ve 15 mililitrelik santrifüj tüp içine aktarın.
Hücreleri saymak için 20 mikrolitrelik bir aliquot alın. NK hücrelerini 400 kez G'de ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. İlk olarak, yuvarlak bir alt elde, kültür 96 iyi plaka tedavi ve metin protokolü tabloda belirtildiği gibi kurmak.
Efektör ve hedef hücrelerin temas halinde olduğundan emin olmak için, 250 kez G'de ispare plakasını dört dakika santrifüj edin. Daha sonra, plakayı nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 5 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Süpernatantların hasat edilmesinden 45 dakika önce, hedef hücre maksimum LDH salınım kuyularına 10 mikrolitre 10 xsis çözeltisi ekleyin ve plakayı nemlendirilmiş odaya geri verin.
Kuluçka tamamlandığında, plakayı 250 kez G'de dört dakika santrifüj edin, ardından her kuyudan 50 mikrolitre aliquot'u yeni 96 kuyulu, düz alt tanzim plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet ternite kullanın. Her bir asay plakasına 50 mikrolitre istiyatriği ekleyin. 30 dakika oda sıcaklığında ışık ve kuluçka dan korumak için folyo ile plaka kapağı.
Bundan sonra, her kuyuya 50 mikrolitre Stop Solution ekleyin. Stop Solution'ı eklediktan sonra plakayı bir saat içinde okuduğunuzdan emin olun ve emiciliği 490 nanometreye kaydedin. NP ve RUPP sıçanlarından elde edilen plasental NK hücreleri 50:1 oranında kendi ortamlarında hedef hücreleri ile beş saat kuluçkaya yatırılır.
490 nanometre de kaydedilen ham emici veri burada gösterilmiştir. Kültürel orta arka plan ve hacim düzeltme kontrol kuyularının ortalama emilmesi hesaplanır ve bu ortalamalar üreticinin protokolünde belirtilen uygun kuyulardan çıkarılır. Düzeltilmiş değerler daha sonra üretici tarafından sağlanan protokol kullanılarak sitotoksisite elde etmek için kullanılır.
Bu yöntem, doğru pipetleme dışında özel beceriler gerektirmese de, mononükleer hücrelerin izolasyonu ve elektasyon plakasının kurulumu, görsel olarak gözlenirse daha kolay anlaşılabilecek ve taklit edilebilen adımlardır. NK hücrelerinin izole edilmesinden sonra, plasental NK hücrelerinin gebelik sırasında ki trofolast göçüne atfedilen rolünü belirlemek için ortak kültür deneyleri gibi bir dizi başka işlem de yapılabilir. Ayrıca, farklı uyarılmış hücrelerden salgılanan sitokinaz'ı değerlendirmek için genişletilmiş NK hücrelerinden medya topluyoruz.
İzole hücrelerin saflığı da akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.
