Este método ayuda a comparar la actividad citotóxica de diferentes tipos de células utilizando un método simple y económico que no requiere equipo especializado. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de materiales peligrosos, es barato, y no requiere el uso de equipos especializados. Este método se puede aplicar para medir la actividad citotóxica de otros tipos de células como EL CD8 más las células citolíticas o incluso para evaluar la muerte espontánea de las células sin incubar, sin células efectos citolíticas.
Los individuos nuevos en esta técnica probablemente tendrán problemas con la optimización de la relación de célula de objetivo a efector. Mi consejo es hacer una búsqueda exhaustiva de la literatura para determinar las proporciones que se probarían al optimizar el protocolo. Aunque este método no requiere habilidades especializadas, aparte de pipetear con precisión, el aislamiento de las células mononucleares y la configuración de la placa de ensayo son pasos que pueden ser más fáciles de entender e imitar si se observan visualmente.
Demostrando el procedimiento estará Chelsea Jekelley, una técnico de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, añada 13,5 mililitros de RPMI en 1,5 mililitros de FBS a un plato de Petri que contenga un filtro de 100 micrómetros. Coloque una placenta en el filtro y utilice el lado plano de un émbolo de jeringa para empujarlo a través del filtro y en la placa Petri.
A continuación, establezca tres tubos cónicos de 15 mililitros para cada tejido. Añadir tres mililitros de medio de gradiente de densidad a cada tubo, y superponer lentamente cinco mililitros de placenta homogeneizada en cada tubo. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante 25 minutos sin rotura.
A continuación, utilice una pipeta de transferencia para recoger la capa de color blanco fino. Añade 10 mililitros de RPMI a las capas de buffy combinadas. Centrifugar a 300 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.
En primer lugar, vuelva a suspender el pellet celular en 50 microlitros de PBS helado. Añadir anticuerpo CD3 con etiqueta de biotina de acuerdo con el protocolo del fabricante y mezclar bien con una pipeta. Coloque el tubo en un rotador de tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, agregue un mililitro de RPMI. Centrifugar a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de RPMI.
Combine la suspensión celular con 150 microlitros de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfiera el tubo a un rotador de tubo y gire mientras incuba a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, recupere el tampón de liberación y déjelo alcanzar la temperatura ambiente en un gabinete de seguridad biológica.
Una vez completada la incubación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante y guardar la población de células negativas CD3 en un tubo de 15 mililitros en hielo. Retire el tubo del imán, agregue un mililitro de RPMI y use una pipeta para mezclar las células y las cuentas cinco veces.
A continuación, vuelva a colocar el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante y guardar la población negativa CD3 en un tubo de 15 mililitros en hielo. Centrifugar la población negativa CD3 de células a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 50 microlitros de PBS helado. Después de esto, agregue el anticuerpo CD161A con la etiqueta de biotina a las células negativas CD3, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezcle bien. Coloque el tubo en un rotador de tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, agregue un mililitro de RPMI y centrífuga a 400 veces G y a cuatro grados Centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de RPMI y combínelo con cuentas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en el rotador del tubo y gire mientras se incuba a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoja el sobrenadante y deseche las células negativas CD3 negativas CD31A. Retire el tubo del imán, agregue un mililitro de RPMI y mezcle bien.
Coloque el tubo en el imán durante un minuto, asegurándose de recoger el sobrenadante y desechar las células negativas CD3 negativas CD161A. Después de esto, retire el tubo del imán y agregue un mililitro de tampón de liberación de temperatura ambiente. Coloque el tubo sobre un rotador de tubo y gire mientras incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Retire el tubo del imán, añada un mililitro de RPMI a temperatura ambiente y mezcle bien.
Coloque el tubo de nuevo debajo del imán durante un minuto, asegurándose de recoger el sobrenadante en el mismo tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle bien y tome una muestra de 20 microlitros para contar las células. Centrifugar las células a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas en RPMI. Siembra las células en una placa de seis pozos a una concentración de 300.000 células por pozo en 2,5 mililitros de medios de activación de células NK. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada durante 48 horas.
En una campana, utilice una pipeta serológica para transferir las células YAC1 en medios a un tubo de 50 mililitros sobre hielo y mezclar bien. Tome una alícuota de 20 microlitores para contar las células. Gire las células a 300 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Usando una pipeta serológica, recoja el sobrenadante de la placa de seis pozos de celda NK previamente preparada en tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue trypsin EDTA a cada pozo. Toque la placa y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados.
Después de que las células hayan incubado con trippsina EDTA durante aproximadamente cinco minutos, utilice un rascador de placa estéril para raspar la placa. A continuación, agregue un mililitro de medios celulares NK a cada pozo. Usando una pipeta serológica, recoja las células y los medios y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Tome una alícuota de 20 microlitores para contar las células. Centrifugar las células NK a 400 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. En primer lugar, obtener un fondo redondo, cultivo tratado 96 placa de pozo y configurarlo como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.
Centrifugar la placa de ensayo a 250 veces G durante cuatro minutos para estar seguro de que el efector y las células diana están en contacto. A continuación, incubar la placa en una cámara humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. 45 minutos antes de cosechar los sobrenadantes, añadir 10 microlitros de solución de lisis 10X a los pozos máximos de liberación de LDH de la célula objetivo y devolver la placa a la cámara humidificada.
Cuando la incubación esté completa, centrifuga la placa a 250 veces G durante cuatro minutos, luego utilice una pipeta multicanal para transferir 50 microlitros alícuotas de cada pozo a una placa de ensayo inferior plana fresca de 96 pocillos. Añadir 50 microlitros de reactivo de ensayo a cada pozo de la placa de ensayo. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de esto, agregue 50 microlitros de Stop Solution a cada pozo. Asegúrese de leer la placa dentro de una hora después de agregar la solución Stop y registre la absorbancia a 490 nanómetros. Las células NK placentarias obtenidas de ratas NP y RUPP se incuban durante cinco horas con células diana en sus respectivos medios con una proporción de 50:1.
Los datos de absorbancia sin procesar registrados a 490 nanómetros se muestran aquí. Se calcula la absorbancia media del fondo del medio cultural y los pozos de control de corrección de volumen, y estos promedios se restan de los pozos apropiados indicados en el protocolo del fabricante. A continuación, los valores corregidos se utilizan para obtener la citotoxicidad utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.
Aunque este método no requiere habilidades especializadas, aparte de pipetear con precisión, el aislamiento de las células mononucleares y la configuración de la placa de ensayo son pasos que pueden ser más fáciles de entender e imitar si se observan visualmente. Después del aislamiento de las células NK, se podrían realizar otros procedimientos, como experimentos de co-cultivo para determinar el papel de las células NK placentarias en la atribución a la migración de trofoblastos durante el embarazo. También recogemos los medios de las células NK expandidas para evaluar la citoquinasa secretada de las células estimuladas diferencialmente.
La pureza de las células aisladas también podría evaluarse a través de la citometría de flujo.
