Questo metodo aiuta a confrontare l'attività citotossica di diversi tipi di cellule utilizzando un metodo semplice ed economico che non richiede attrezzature specializzate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede l'uso di materiali pericolosi, è economico e non richiede l'uso di attrezzature specializzate. Questo metodo può essere applicato per misurare l'attività citotossica di altri tipi di cellule come CD8 più cellule citolitiche o anche per valutare la morte spontanea di cellule senza incubare, senza cellule effettore citolitiche.
Gli individui nuovi a questa tecnica probabilmente avranno difficoltà con l'ottimizzazione del rapporto tra bersaglio e cella dell'effettore. Il mio consiglio è di fare una ricerca approfondita della letteratura per determinare i rapporti che si eservirebbero durante l'ottimizzazione del protocollo. Sebbene questo metodo non richieda competenze specializzate, oltre alla pipettazione con precisione, l'isolamento delle cellule mononucleari e la configurazione della piastra di dosaggio sono passaggi che possono essere più facili da capire e mimicked se osservati visivamente.
A dimostrare la procedura sarà Chelsea Jekelley, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungere 13,5 millilitri di RPMI in 1,5 millilitri di FBS a una piastra di Petri contenente un filtro da 100 micrometri. Posizionare una placenta sul filtro e utilizzare il lato piatto di uno stantuffo per siringhe per spingerlo attraverso il filtro e nella piastra di Petri.
Successivamente, impostare tre tubi conici da 15 millilitri per ogni tessuto. Aggiungere tre millilitri di gradiente di densità medio a ciascun tubo e sovrapporre lentamente cinque millilitri di placenta omogeneizzata in ogni tubo. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per 25 minuti senza pausa.
Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il sottile strato di buffy bianco. Aggiungere 10 millilitri di RPMI agli strati di buffy combinati. Centrifugare a 300 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti e scartare il supernatante.
In primo luogo, sospendere di nuovo il pellet cellulare in 50 microlitri di PBS ghiacciato. Aggiungere anticorpo CD3 con etichetta biotina secondo il protocollo del produttore e mescolare bene con una pipetta. Posizionare il tubo in un rotatore del tubo e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Aggiungere quindi un millilitro di RPMI. Centrifuga a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di RPMI.
Unire la sospensione cellulare con 150 microlitri di perline magnetiche in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Trasferire il tubo su un rotatore di tubi e ruotare durante l'incubazione a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, recuperare il tampone di rilascio e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente in un armadio di sicurezza bio.
Al termine dell'incubazione, posizionare il tubo nel magnete per un minuto. Raccogli il supernatante e salva la popolazione di cellule negative cd3 in un tubo da 15 millilitri sul ghiaccio. Rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere un millilitro di RPMI e utilizzare una pipetta per mescolare le cellule e le perline cinque volte.
Quindi, riposizionare il tubo nel magnete per un minuto. Raccogli il supernatante e salva la popolazione negativa del CD3 in un tubo da 15 millilitri sul ghiaccio. Centrifugare la popolazione negativa di cellule CD3 a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 50 microlitri di PBS ghiacciato. Successivamente, aggiungere l'anticorpo CD161A con etichetta biotina alle cellule negative CD3, secondo le istruzioni del produttore e mescolare bene. Posizionare il tubo in un rotatore del tubo e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi, aggiungere un millilitro di RPMI e centrifuga a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di RPMI e combinarlo con perline magnetiche in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo nel rotatore del tubo e ruotare durante l'incubazione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, posizionare il tubo nel magnete per un minuto. Raccogliere il supernatante e scartare le celle negative CD3 negative CD161A. Rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere un millilitro di RPMI e mescolare bene.
Posizionare il tubo nel magnete per un minuto, assicurandosi di raccogliere il supernatante e scartare le celle negative CD3 CD161A. Successivamente, rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere un millilitro di tampone di rilascio della temperatura ambiente. Posizionare il tubo su un rotatore del tubo e ruotare durante l'incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, posizionare il tubo nel magnete per un minuto. Raccogli il supernatante in un nuovo tubo conico da 15 millilitri sul ghiaccio. Rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere un millilitro di RPMI a temperatura ambiente e mescolare bene.
Riposizionare il tubo sotto il magnete per un minuto, assicurandosi di raccogliere il supernatante nello stesso tubo conico da 15 millilitri. Mescolare bene e prendere un campione di 20 microliter per contare le cellule. Centrifugare le cellule a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le celle in RPMI. Seminare le cellule in una piastra di sei pozzi ad una concentrazione di 300.000 cellule per pozzo in 2,5 millilitri di mezzi di attivazione cellulare NK. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% in un incubatore umidificato per 48 ore.
In una cappa, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire celle YAC1 in mezzi su un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio e mescolare bene. Prendi un'aliquota di 20 microliter per contare le cellule. Ruotare le cellule a 300 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere il supernatante dalla cella NK precedentemente preparata sei piastre di pozzo in tubo conico da 15 millilitri. Quindi, aggiungere triptarina EDTA a ogni pozzo. Tocca il piatto e posizionalo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Dopo che le cellule hanno incubato con tripina EDTA per circa cinque minuti, utilizzare un raschietto sterile per raschiare la piastra. Quindi aggiungere un millilitro di supporto cellulare NK a ogni pozzo. Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere le cellule e i mezzi e trasferirli in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Prendi un'aliquota di 20 microliter per contare le cellule. Centrifugare le cellule NK a 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. In primo luogo, ottenere un fondo rotondo, le impostazioni cultura trattate 96 piastra di pozzo e impostarlo come delineato nella tabella uno del protocollo di testo.
Centrifugare la piastra di dosaggio a 250 volte G per quattro minuti per essere certi che l'effettore e le cellule bersaglio siano in contatto. Successivamente, incubare la piastra in una camera umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per cinque ore. 45 minuti prima della raccolta dei supernaganti, aggiungere 10 microlitri di soluzione di lisi 10X ai pozzi massimi di rilascio LDH della cella target e riportare la piastra nella camera umidificata.
Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra a 250 volte G per quattro minuti, quindi utilizzare un pipetter multicanale per trasferire 50 aliquote microliter da ogni pozzo a una piastra di dosaggio inferiore piatta fresca da 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di reagente di dosaggio ad ogni pozzo della piastra di dosaggio. Coprire la piastra con un foglio per proteggerla dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Successivamente, aggiungere 50 microlitri di Stop Solution ad ogni pozzo. Assicurarsi di leggere la piastra entro un'ora dall'aggiunta della soluzione di arresto e registrare l'assorbanza a 490 nanometri. Le cellule NK placentare ottenute da ratti NP e RUPP vengono incubate per cinque ore con cellule bersaglio nei rispettivi mezzi ad un rapporto di 50:1.
I dati sull'assorbanza grezza registrati a 490 nanometri sono mostrati qui. Vengono calcolate l'assorbanza media del background del mezzo culturale e i pozzi di controllo della correzione del volume, e queste medie vengono sottratte dai pozzi appropriati indicati nel protocollo del produttore. I valori corretti vengono quindi utilizzati per ottenere la citotossicità utilizzando il protocollo fornito dal produttore.
Sebbene questo metodo non richieda competenze specializzate, oltre alla pipettazione con precisione, l'isolamento delle cellule mononucleari e la configurazione della piastra di dosaggio sono passaggi che possono essere più facili da capire e mimicked se osservati visivamente. Dopo l'isolamento delle cellule NK, potrebbero essere eseguite una serie di altre procedure, come esperimenti di co-coltura per determinare il ruolo delle cellule NK placentare nell'attribuire alla migrazione dei trofoblasti durante la gravidanza. Raccogliamo anche i supporti dalle cellule NK espanse per valutare la citochinasi secreta dalle cellule stimolate in modo differenziato.
La purezza delle cellule isolate potrebbe anche essere valutata tramite citometria del flusso.
