この方法は、特殊な装置を必要としない簡単で安価な方法を用いて、異なる細胞型の細胞傷害活性を比較するのに役立ちます。この技術の主な利点は、危険物の使用を必要とせず、安価であり、特殊な機器の使用を必要としないことです。この方法は、CD8+細胞分解細胞などの他の細胞タイプの細胞傷害活性を測定したり、細胞の培養を行わずに細胞の自発的死を評価したりするために適用することができます。
この技術に新しい個人は、エフェクター細胞比への目標の最適化に苦労する可能性が高い.私のアドバイスは、プロトコルを最適化するときにテストする比率を決定するために文献を徹底的に検索することです。この方法は、正確にピペットを行う以外に専門的なスキルを必要としませんが、単核細胞の単離とアッセイプレートのセットアップは、視覚的に観察されれば理解され、模倣することができるステップです。
手順を実証することは、私の研究室の技術者であるチェルシー・ジェケリーです。この手順を開始するには、100マイクロメートルフィルターを含むペトリ皿に1.5ミリリットルのFBSで13.5ミリリットルのRPMIを加えます。フィルターに1つの胎盤を置き、注射器プランジャーの平らな側面を使用して、フィルターを通してペトリ皿に押し込みます。
次に、各組織に対して3本の15ミリリットル円錐管をセットする。各チューブに3ミリリットルの密度勾配媒体を加え、均質化された胎盤の5ミリリットルを各チューブにゆっくりと重ね合わせていきます。Gの300倍、室温で25分間、休憩なしで遠心分離機。
次に、移管ピペットを使用して薄い白いバフィー層を採取する。組み合わせたバフィー層にRPMIを10ミリリットル加えます。遠心分離機はGの300倍、摂氏4度で10分間、上清を捨てます。
まず、50マイクロリットルの氷冷PBSで細胞ペレットを再懸濁する。メーカーのプロトコルに従ってビオチン標識CD3抗体を加え、ピペットとよく混ぜます。チューブをチューブ回転器に入れ、摂氏4度で20分間インキュベートします。
次に、RPMIを1ミリリットル加えます。400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、RPMIの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。
1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに150マイクロリットルの磁気ビーズと細胞懸濁液を組み合わせます。チューブをチューブ回転器に移し、摂氏4度で30分間インキュベートしながら回転させます。インキュベーション中に、放出バッファーを取り出し、バイオセーフティキャビネット内の室温に達させます。
インキュベーションが完了したら、チューブをマグネットに1分間入れ、上清を収集し、氷の上の15ミリリットルのチューブにCD3陰性細胞集団を保存します。磁石からチューブを取り出し、RPMIを1ミリリットル加え、ピペットを使って細胞とビーズを5回混合します。
その後、チューブを磁石に1分間戻します。上清を収集し、氷の上の15ミリリットルのチューブにCD3負の集団を保存します。遠心分離機は、細胞のCD3負の集団をGの400倍、摂氏4度で10分間遠心する。
上清を捨て、50マイクロリットルの氷冷PBSで細胞ペレットを再懸濁します。この後、メーカーの指示に従って、CD3陰性細胞にビオチン標識CD161A抗体を追加し、よく混ぜます。チューブをチューブ回転器に入れ、摂氏4度で20分間インキュベートします。
次に、400倍GでRPMIと遠心分離機を1ミリリットル、摂氏4度で10分間加えます。上清を捨て、RPMIの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに磁気ビーズと組み合わせます。チューブをチューブ回転器に入れ、摂氏4度で30分間インキュベートしながら回転させます。
その後、チューブを磁石に1分間入れ、上清を収集し、CD3負のCD161A負の細胞を捨てます。磁石からチューブを取り出し、RPMIを1ミリリットル加え、よく混ぜます。
チューブをマグネットに1分間入れ、上清を収集し、CD3陰性CD161A陰性セルを廃棄します。この後、マグネットからチューブを取り出し、室温解放バッファーの1ミリリットルを追加します。チューブをチューブ回転器に置き、室温で15分間インキュベートしながら回転させます。
次に、チューブを磁石に1分間入れます。氷の上の新しい15ミリリットルの円錐管に上清を集める。磁石からチューブを取り出し、室温RPMIを1ミリリットル加え、よく混ぜます。
チューブを磁石の下に1分間戻し、同じ15ミリリットルの円錐形チューブに上清を必ず集める。よく混ぜて、細胞を数えるために20マイクロリットルのサンプルを取ります。細胞をGの400倍、摂氏4度で10分間遠心分離する。
上清を取り除き、RPMIでセルを再中断します。NK細胞活性化培地の2.5ミリリットルでウェルあたり300,000細胞の濃度で6ウェルプレートに細胞を播種します。加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素を摂氏37度で48時間インキュベートします。
フードには、血清学的ピペットを使用して、培地中のYAC1細胞を氷上の50ミリリットルチューブに移し、よく混ぜます。細胞を数えるために20マイクロリットルのアリコートを取る。細胞をGの300倍、摂氏4度で10分間回転させます。
血清ピペットを使用して、15ミリリットル円錐管内の前に準備したNK細胞6ウェルプレートから上清を収集します。次に、トリプシンEDTAを各ウェルに追加します。プレートをタップし、37°Cのインキュベーターに入れ。
細胞が約5分間トリプシンEDTAでインキュベートした後、滅菌プレートスクレーパーを使用してプレートを削ります。その後、各ウェルにNK細胞培地を1ミリリットル加えます。血清ピペットを使用して、細胞および培地を収集し、15ミリリットルの遠心分離管に移します。
細胞を数えるために20マイクロリットルのアリコートを取る。NK細胞をGの400倍、摂氏4度で10分間遠心する。まず、丸底を得て、培養物を96ウェルプレートに扱い、テキストプロトコルの表1に概説されているように設定する。
アッセイプレートを4分間Gの250倍に遠心分離し、エフェクターと標的細胞が接触していることを確認した。次に、5%の二酸化炭素を加湿したチャンバーに5時間インキュベートします。上清を収穫する45分前に、10マイクロリットルの10マイクロリットルの溶解液をターゲットセル最大LDH放出ウェルに加え、プレートを加湿チャンバに戻します。
インキュベーションが完了したら、250回Gでプレートを4分間遠心分離し、マルチチャネルピペッタを使用して、すべてのウェルから新鮮な96ウェル、平らな底アッセイプレートに50マイクロリットルのアリコートを転送します。アッセイプレートの各ウェルに50マイクロリットルのアッセイ試薬を加えます。プレートをホイルで覆って光から保護し、室温で30分間インキュベートします。
この後、各ウェルに50マイクロリットルのストップソリューションを加えます。ストップソリューションを追加してから1時間以内にプレートを読み取り、490ナノメートルで吸光度を記録してください。NPおよびRUPPラットから得られた胎盤NK細胞は、それぞれの培地中の標的細胞と共に50:1の比率で5時間インキュベートされる。
490ナノメートルで記録された生の吸光度データをここに示す。文化媒体の背景と体積補正制御ウェルの平均吸光度が計算され、これらの平均は製造業者のプロトコルで示された適切なウェルから差し引かれる。その後、修正された値を使用して、製造業者が提供するプロトコルを使用して細胞毒性を得る。
この方法は、正確にピペットを行う以外に専門的なスキルを必要としませんが、単核細胞の単離とアッセイプレートのセットアップは、視覚的に観察されれば理解され、模倣することができるステップです。NK細胞の単離後、妊娠中の栄養芽球移動に起因する胎盤NK細胞の役割を決定する共培養実験など、他にも多くの処置を行うことができる。また、拡大したNK細胞から培地を収集し、微分刺激細胞から分泌されるサイトキナーゼを評価します。
単離された細胞の純度は、フローサイトメトリーを介して評価することもできる。
