שיטה זו מסייעת להשוות את הפעילות הציטוקקסית של סוגי תאים שונים באמצעות שיטה פשוטה וזולים שאינה דורשת ציוד מיוחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש בחומרים מסוכנים, היא זולה, ואינו דורש שימוש בציוד מיוחד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי למדוד פעילות cytotoxic של סוגי תאים אחרים כגון CD8 בתוספת תאים ציטופליטיים או אפילו כדי להעריך מוות ספונטני של תאים ללא דגירה, ללא תאים משפיעים ציטוליטי.
אנשים חדשים בטכניקה זו צפויים להיאבק עם אופטימיזציה של יחס תאים אפקטר. העצה שלי היא לעשות חיפוש יסודי בספרות כדי לקבוע את היחסים שהיית לבדוק בעת אופטימיזציה של הפרוטוקול. למרות ששיטה זו אינה דורשת מיומנויות מיוחדות, מלבד צינורות במדויק, הבידוד של תאים mononuclear ואת ההתקנה של לוח הבדיקה הם צעדים שניתן להבין בקלות ולחקות אם הם נצפו חזותית.
הפגנת ההליך תהיה צ'לסי ג'קלי, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף 13.5 מיליליטר של RPMI ב 1.5 מיליליטר של FBS לצלחת פטרי המכיל מסנן 100 מיקרומטר. מניחים שליה אחת על המסנן ולהשתמש בצד השטוח של בוכנה מזרק לדחוף אותו דרך המסנן לתוך צלחת פטרי.
לאחר מכן, קבעו שלושה צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר לכל רקמה. מוסיפים שלושה מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לכל צינור, ולאט לאט כיסוי חמישה מיליליטר של שליה הומוגנית לתוך כל צינור. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות ללא הפסקה.
לאחר מכן, השתמש פיפטה העברה כדי לאסוף את שכבת באפי לבן דק. הוסיפו 10 מיליליטר של RPMI לשכבות הבובי המשולבות. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant.
ראשית, להשעות מחדש את גלולת התא ב50 microliters של PBS קר כקרח. מוסיפים נוגדן CD3 עם תווית ביוטין בהתאם לפרוטוקול היצרן ומערבבים היטב עם פיפטה. מניחים את הצינור לתוך מסובב צינור ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של RPMI. צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של RPMI.
שלב את מתלי התא עם 150 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מעבירים את הצינור לצינור מסתובב ומסתובבים תוך כדי דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך הדגירה, לאחזר את חיץ השחרור ולתת לו להגיע לטמפרטורת החדר בארון בטיחות ביו.
לאחר שה הדגירה הושלמה, מניחים את הצינור במגנט למשך דקה אחת. לאסוף את supernatant ולשמור את אוכלוסיית התאים השליליים CD3 בצינור 15 מיליליטר על קרח. הסר את הצינור מן המגנט, להוסיף מיליליטר אחד של RPMI ולהשתמש פיפטה לערבב את התאים ואת חרוזים חמש פעמים.
לאחר מכן, מניחים את הצינור בחזרה לתוך המגנט לדקה אחת. לאסוף את supernatant ולשמור את האוכלוסייה השלילית CD3 בצינור 15 מיליליטר על קרח. צנטריפוגה האוכלוסייה השלילית CD3 של תאים ב 400 פעמים G ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב-50 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח. לאחר מכן, להוסיף ביוטין שכותרתו CD161A נוגדן לתאים שליליים CD3, על פי הוראות היצרן לערבב היטב. מניחים את הצינור בצינור מסתובב ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של RPMI וצנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של RPMI ושלבו אותו עם חרוזים מגנטיים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור בצינור מסתובב ומסובבים תוך כדי דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן, מניחים את הצינור במגנט לדקה אחת. לאסוף את supernatant ולמחוק CD3 שלילי CD161A תאים שליליים. מוציאים את הצינור מהמגנט, מוסיפים מיליליטר אחד של RPMI ומערבבים היטב.
מניחים את הצינור במגנט למשך דקה אחת, הקפד לאסוף את supernatant ולזרוק את CD3 שלילי CD161A תאים שליליים. לאחר מכן, להסיר את הצינור מן המגנט ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ שחרור טמפרטורת החדר. מניחים את הצינור על מסובב צינור ולסובב תוך דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מניחים את הצינור במגנט לדקה אחת. לאסוף את העל-טבעי בצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר על קרח. מוציאים את הצינור מהמגנט, מוסיפים מיליליטר של RPMI בטמפרטורת החדר ומערבבים היטב.
מניחים את הצינור בחזרה מתחת למגנט לדקה אחת, הקפד לאסוף את supernatant באותו צינור חרוט 15 מיליליטר. מערבבים היטב ולקחת מדגם 20 microliter לספור את התאים. צנטריפוגה התאים ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב- RPMI. זרע את התאים לתוך צלחת שש באר בריכוז של 300, 000 תאים ל הבאר ב 2.5 מיליליטר של מדיה הפעלת תא NK. אינקובט ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני באינקובטור לח במשך 48 שעות.
במכסה המנוע, השתמש פיפטה סרולוגית להעביר תאי YAC1 במדיה לצינור 50 מיליליטר על קרח ומערבבים היטב. קח aliquot 20 microliter לספור את התאים. לסובב את התאים ב 300 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
באמצעות פיפטה סרולוגית, לאסוף את supernatant מתא NK שהוכן בעבר שש צלחת גם בצינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף טריפסין EDTA לכל באר. הקש על הצלחת והצב אותה באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר התאים יש דגירה עם טריפסין EDTA במשך כחמש דקות, להשתמש מגרד צלחת סטרילית כדי לגרד את הצלחת. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיה סלולרית NK לכל באר. באמצעות פיפטה סרולוגית, לאסוף את התאים והמדיה ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
קח aliquot 20 microliter לספור את התאים. צנטריפוגה תאי NK ב 400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ראשית, להשיג תחתית עגולה, התרבות התייחסה 96 צלחת היטב ולהגדיר אותו כמתואר בטבלה אחד של פרוטוקול הטקסט.
צנטריפוגה צלחת ההתחשמלות ב 250 פעמים G במשך ארבע דקות כדי להיות בטוח כי המחולל ותאי היעד נמצאים במגע. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. 45 דקות לפני קצירת supernatants, להוסיף 10 microliters של פתרון תיזה 10X לתא היעד מקסימום בארות שחרור LDH ולהחזיר את הצלחת לתא לח.
כאשר הדגירה הושלמה, צנטריפוגה את הצלחת ב 250 פעמים G במשך ארבע דקות, ולאחר מכן להשתמש pipetter רב ערוצי להעביר 50 aliquots microliter מכל באר לטרי 96-גם, צלחת בדיקה תחתונה שטוחה. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של ריג'נטים לכל באר של צלחת ההתנסויות. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי להגן עליה מפני אור ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של פתרון עצור לכל באר. הקפד לקרוא את הצלחת בתוך שעה אחת של הוספת פתרון עצור ולתקליט את הספיגה ב 490 ננומטר. תאי NK שליה המתקבלים מחולדות NP ו- RUPP דגירה במשך חמש שעות עם תאי יעד במדיה המתאימה שלהם ביחס של 50:1.
נתוני הספיגה הגולמית שנרשמו ב-490 ננומטר מוצגים כאן. הספיגה הממוצעת של הרקע הבינוני התרבותי וגם בקרת תיקון העוצמה מחושבות, וממוצעים אלה מופחתים מה בארות המתאימות המצוינות בפרוטוקול היצרן. הערכים מתוקנים משמשים לאחר מכן כדי להשיג את cytotoxicity באמצעות הפרוטוקול שסופק על-ידי היצרן.
למרות ששיטה זו אינה דורשת מיומנויות מיוחדות, מלבד צינורות במדויק, הבידוד של תאים mononuclear ואת ההתקנה של לוח הבדיקה הם צעדים שניתן להבין בקלות ולחקות אם הם נצפו חזותית. לאחר בידוד של תאי NK, ניתן לבצע מספר הליכים אחרים, כגון ניסויים בתרבות שותף כדי לקבוע את תפקידם של תאי NK שליה ייחוס ההגירה trophoblast במהלך ההריון. אנחנו גם אוספים את המדיה מתאים NK המורחבת כדי להעריך ציטוקינאז מופרש מן התאים מגורה דיפרנציאלית.
ניתן להעריך גם את טוהר התאים המבודדים באמצעות ציטומטריית זרימה.
