قيمة هذا البروتوكول هو أنه يسمح تقريبا أي سلالة من discoideum dictyostelium أن يتم التلاعب بها من قبل علم الوراثة الجزيئية، بغض النظر عما إذا كانت تلك السلالة سوف تنمو axnically في المتوسطة السائلة أم لا. الميزة الأخرى لهذه التقنية هي أنها سريعة وبسيطة. نقل إلى الخلايا عبرfect مع البلازمي exochromosomal قبل البدء في مزج dictyosteliums.
يمكن التحقق من صحة النتائج بالفعل بعد يومين من نقل الرضاخ باستخدام المجهر. ومن غير المعتاد العمل مع خلايا dictyostelium وتعليق البكتيريا. سوف التصور تساعد على إعطاء المجربين فكرة كيف يتم تنفيذ الخطوات المختلفة للبروتوكولات.
إثبات الإجراء معي سيكون سودابة إيمانيكيا، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء، وإعداد 1000 ملليلتر من محلول عمل سورنسن العازلة مع كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك، استخدام مستعمرة واحدة من أيوجينات K لتطعيم لتر واحد من متوسطة LB.
السماح للبكتيريا أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. تدور الخلايا في اثنين من أنابيب الطرد المركزي 500 ملليلتر لحصاد الخلايا. ثم، وغسل البكتيريا مرة واحدة مع 500 ملليلتر من العازلة.
إعادة بناء بيليه في 20 ملليلتر من العازلة. استخدم مقياس ضوئي للتحقق من الكثافة البصرية للعينة وتمييع العينة مع المخزن المؤقت حتى تبلغ الكثافة البصرية حوالي 100. بعد ذلك، قم بإعداد المخزن المؤقت للكهربة H40 وفقًا لبروتوكول النص.
تنمو ك aerogenes لالتقاء متوسطة SM بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إضافة 400 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى لوحة أجار SM ونشرها بالتساوي. ثم، واتخاذ حلقة عقيمة وتطعيم مع خلايا dictyostelium ونشر الخلايا على حافة واحدة من لوحة.
احتضان لوحة في 22 درجة مئوية لمدة يومين، لضمان مناطق النمو كبيرة بما يكفي لtransfete. أضف 10 ملليلترات من تعليق الأيروجين K إلى طبق بيتري معالج بثقافة الأنسجة طوله 10 سنتيمترات. ثم، استخدم حلقة تطعيم 10 ميكرولتر يمكن التخلص منها لكشط الخلايا من مناطق النمو في لوحة الثقافة.
نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على الجليد الباردة H40 العازلة. تدور الخلايا لمدة ثانيتين في 10000 مرة الجاذبية. ثم، تجاهل عظمى وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت H40.
بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على ميكروغرام واحد إلى اثنين من الحمض النووي. الماصات صعودا وهبوطا لخلط ونقل خليط الحمض النووي الخلية إلى cuvette الكهربائي قبل المبردة. لا تضيف أكثر من اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي.
أعلى تركيز الحمض النووي هي سامة للخلايا والحد من الكفاءة. بعد الكهربة، نقل الخلايا على الفور إلى طبق بيتري معد 10 سنتيمترا والسماح للخلايا للتعافي لمدة خمس ساعات. لتحديد transfectant لضربة قاضية ، بالضربة القاضية ، أو فعل خمسة في الضربة القاضية ، وفصل الخلايا من طبق بيتري عن طريق الأنابيب السائل على السطح.
ثم، اقامة ثلاثة تخفيفات من عامل انتقائي وفقا لبروتوكول النص. وأخيرا، توزيع 150 ميكرولترات من التخفيفات المعدة في كل بئر من 96-جيدا مسطح القاع لوحات ثقافة الأنسجة. في هذا البروتوكول، تم عرض نظام بلازمي خارج هتكروموسوم مراسل مزدوج.
بعد 32 ساعة من عملية التهيّن، عبّرت غالبية الخلايا عن كلا بروتينات الانصهار ذات التسمية الفلورية. كما حاول قانون خمسة M الكرز طرق الدخول وNNC4. تم الحصول على اثنين من العصابات بعد تشغيل هضم على هلام agarose.
يحتوي شريط زوج 4127 الأساسي على البناء المطلوب. تم استخدام الحمض النووي المنقى لتحول خلايا NC4. تم تحليل اثنين من استنساخ من نقل NC4 عن طريق PCR وكلاهما أظهر أنماط الفرقة المتوقعة.
ثم استخدمت البقعة الجنوبية للتحقق من صحة نتائج PCR. نمت NC4 بشكل أسرع على المروج البكتيرية من خلايا Ax2. بعد أربع ساعات، تمكن المزيد من خلايا NC4 من الزحف تحت أغاروز من خلايا Ax2.
كانت خلايا NC4 أسرع وأظهرت استجابة كيمائية أقوى للفولات من خلايا Ax2. دائما استخدام الخلايا من إعداد حديثا حتى لوحات SM. أبدا استخدام الخلايا أقدم من أربعة أيام، وإلا سوف تنخفض الكفاءة.
سلالات هايب البيضاء المعزولة حديثاً، غير إضاءات يشيع استخدامها لمعالجة الأسئلة المتعلقة بالسلوك الاجتماعي أو السلوك الاجتماعي للديكتيوستيليوم. يسمح لدينا لتطبيق علم الوراثة الجزيئية من خلال تلك العزلات.
