הערך של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר כמעט כל זן של דיסקואידום dictyostelium להיות מניפולציה על ידי גנטיקה מולקולרית, ללא קשר אם זן זה יגדל axenically במדיום נוזלי או לא. היתרון השני של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ופשוטה. יש לבצע חילוף של תאים עם פלסמיד אקסוכרומוזומלי לפני שמתחילים לערבב דיקטיוסטליום.
התוצאות כבר ניתן לאמת יומיים לאחר transfection באמצעות מיקרוסקופיה. זה יוצא דופן לעבוד עם תאי דיסטיוסטליום והשעיית חיידקים. הדמיה תעזור לתת לנסיינים מושג כיצד מבוצעים השלבים השונים של הפרוטוקולים.
הדגמת ההליך איתי תהיה סודבה אימניקיה, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין 1000 מיליליטר של חיץ סורנסן עובד פתרון עבודה עם מגנזיום כלורי סידן כלורי על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמש במושבה אחת של K aerogenes כדי לחסן ליטר אחד של מדיום LB.
אפשר לחיידקים לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. לסובב את התאים למטה בשני צינורות צנטריפוגה 500 מיליליטר כדי לקצור את התאים. לאחר מכן, לשטוף את החיידקים פעם אחת עם 500 מיליליטר של חיץ.
תן שימוש חוזר לכדור ב-20 מיליליטר של חיץ. השתמש photometer כדי לבדוק את הצפיפות האופטית של המדגם לדלל את המדגם עם חיץ עד הצפיפות האופטית היא כ 100. לאחר מכן, הכן את מאגר האלקטרופולציה H40 בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לגדל K aerogenes כדי לאנסף אמצעי SM לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מתלים חיידקיים לצלחת אגר SM ומפיצים אותה באופן שווה. לאחר מכן, לקחת לולאה סטרילית לחסן אותו עם תאים דיקטיוסטליום ולהפיץ את התאים בקצה אחד של הצלחת.
הדגירה את הצלחת ב 22 מעלות צלזיוס במשך יומיים, כדי להבטיח את אזורי הצמיחה גדולים מספיק עבור transfection. הוסיפו 10 מיליליטר של השעיית K aerogene לצלחת פטרי שטופלה בתרבות רקמה של 10 ס"מ. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון חד פעמית 10 microliter כדי לגרד תאים אזורי הצמיחה של צלחת התרבות.
העבר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, המכיל חיץ H40 קר כקרח. סובב את התאים לשתי שניות בכבידה של פי 10000. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים במאגר H40.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של התאים לצינור המכיל אחד עד שני מיקרוגרם של DNA. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר את תערובת הדנ"א של התאים לקעת אלקטרופורציה מצוננת מראש. אין להוסיף יותר משני מיקרוגרם דנ"א.
ריכוז דנ"א גבוה יותר רעיל לתאים ומפחית את היעילות. לאחר אלקטרופורציה, מיד להעביר את התאים לצלחת פטרי מוכן 10 ס"מ ולאפשר לתאים להתאושש במשך חמש שעות. כדי לבחור transfectant עבור נוקאאוט, נוק-אין, או מעשה חמש לדפוק ב, לנתק את התאים מן צלחת פטרי על ידי צינור נוזל על פני השטח.
לאחר מכן, הגדר שלושה דילולים של הסוכן הסלקטיבי על פי פרוטוקול הטקסט. לבסוף, להפיץ 150 microliters של דילול מוכן לתוך כל באר של 96 גם שטוח למטה רקמות צלחות תרבות. בפרוטוקול זה, הוכחה מערכת פלסמיד חוץ-כרומוזומלית של כתב כפול.
32 שעות לאחר ההיתוך, רוב התאים הביעו שני חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. כמו כן נוסו נוקאאוט דובדבנים של מערכה 5 M ו-NC4. שתי להקות הושגו לאחר הפעלת העיכול על ג'ל אגרוז.
רצועת זוג הבסיס 4127 מכילה את המבנה הרצוי. הדנ"א המטוהר שימש להתרה של תאי NC4. שני שיבוטים של ההמרה NC4 נותחו באמצעות PCR ושניהם הראו את דפוסי הלהקה החזויים.
כתם דרומי שימש אז כדי לאמת את התוצאות של PCR. NC4 גדל מהר יותר על מדשאות חיידקים מאשר תאים Ax2. לאחר ארבע שעות, יותר של תאים NC4 הצליחו לזחול מתחת agarose מאשר תאים Ax2.
תאי ה-NC4 היו מהירים יותר והראו תגובה כימוטקטית חזקה יותר לאפולאט מאשר לתאי ה-Ax2. השתמש תמיד בתאים מצלחות SM שהגדירו זה את זה. לעולם אל תשתמש בתאים מעל ארבעה ימים, אחרת היעילות תרד.
זני HAP לבנים ומבודדים טריים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות הנוגעות להתנהגות רועמת או חברתית של דיקסטיוסטליום. שלנו מאפשר ליישם גנטיקה מולקולרית דרך מבודדים אלה.
