O valor deste protocolo é que permite que quase qualquer cepa de dictyostelium discoideum seja manipulada pela genética molecular, independentemente de essa cepa crescer axenicamente em meio líquido ou não. A outra vantagem dessa técnica é que ela é rápida e simples. Transponha para transfectar células com um plasmídeo exocromosomal antes de começar a misturar dictyosteliums.
Os resultados já podem ser validados dois dias após a transfecção usando microscopia. É incomum trabalhar com células de dictyostelium e suspensão de bactérias. A visualização ajudará a dar aos experimentadores uma ideia de como as diferentes etapas dos protocolos são realizadas.
Demonstrando o procedimento comigo será Soudabeh Imanikia, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, prepare 1000 mililitros de solução de trabalho tampão sorensen com cloreto de magnésio e cloreto de cálcio de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, use uma única colônia de k aerogenes para inocular um litro de meio LB.
Permita que as bactérias cresçam durante a noite a 37 graus celsius com tremor. Gire as células em dois tubos de centrífuga de 500 mililitros para colher as células. Em seguida, lave as bactérias uma vez com 500 mililitros de tampão.
Resuspende a pelota em 20 mililitros de tampão. Use um fotômetro para verificar a densidade óptica da amostra e diluir a amostra com buffer até que a densidade óptica seja de cerca de 100. Depois disso, prepare o tampão de eletroporação H40 de acordo com o protocolo de texto.
Cresça aerogenes K para confluência de um meio SM durante a noite à temperatura ambiente. Adicione 400 microliters de suspensão bacteriana a uma placa de ágar SM e espalhe-a uniformemente. Em seguida, pegue um laço estéril e inocula-o com células de dictyostelium e espalhe as células em uma borda da placa.
Incubar a placa a 22 graus Celsius por dois dias, para garantir que as zonas de crescimento sejam grandes o suficiente para transfecção. Adicione 10 mililitros de suspensão de aerogene K a uma placa de Petri tratada com cultura de tecido de 10 centímetros. Em seguida, use um laço de inoculação descartável de 10 microliter para raspar as células das zonas de crescimento da placa de cultura.
Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro, contendo tampão H40 gelado. Gire as células por dois segundos a 10.000 vezes a gravidade. Em seguida, descarte o supernasciente e resuspenque as células no buffer H40.
Em seguida, adicione 100 microliters das células a um tubo contendo um a dois microgramas de DNA. Pipeta para cima e para baixo para misturar e transferir a mistura de DNA celular para um cuvette de eletroporação pré-refrigerado. Não adicione mais de dois microgramas de DNA.
Maior concentração de DNA são tóxicas para as células e reduzem a eficiência. Após a eletroporação, transfira imediatamente as células para uma placa de Petri preparada de 10 centímetros e permita que as células se recuperem por cinco horas. Para selecionar um transfetante para um knock-out, knock-in, ou um ato cinco knock-in, desprender as células da placa de Petri por pipetizar líquido sobre a superfície.
Em seguida, configure três diluições do agente seletivo de acordo com o protocolo de texto. Finalmente, distribua 150 microliters das diluições preparadas em cada poço de 96 placas de cultura de tecido de fundo plano. Neste protocolo, foi demonstrado um sistema plasmídeo extracromosomal de repórter duplo.
32 horas após a transfecção, a maioria das células expressou ambas as proteínas de fusão rotuladas fluorescentes. Um ato de cinco M cherry knock-in e um NC4 também foi tentado. Duas bandas foram obtidas depois de executar o digestão em um gel de agarose.
A banda de par de base 4127 contém a construção desejada. O DNA purificado foi usado para a transfecção de células NC4. Dois clones da transfecção NC4 foram analisados via PCR e ambos mostraram os padrões de banda previstos.
A mancha sulista foi então usada para validar os resultados da PCR. O NC4 cresceu mais rápido em gramados bacterianos do que as células Ax2. Depois de quatro horas, mais células NC4 foram capazes de rastejar sob a agarose do que as células Ax2.
As células NC4 eram mais rápidas e apresentavam resposta quimotactica mais forte ao folato do que as células Ax2. Use sempre células de placas SM recém-configuradas. Nunca use células com mais de quatro dias, caso contrário a eficiência cairá.
Cepas de HAP brancas recém-isoladas, não atenuantes, são comumente usadas para abordar questões relativas a um comportamento ruching ou social de dictyosteliums. Nossa permite aplicar genética molecular através desses isolados.
