El valor de este protocolo es que permite que casi cualquier cepa de dictyostelium discoideum sea manipulada por genética molecular, independientemente de si dicha cepa crecerá axíricamente en medio líquido o no. La otra ventaja de esta técnica es que es rápida y sencilla. Transponer a células transfectales con un plásmido exocromosomal antes de comenzar a mezclar dictyostelios.
Los resultados ya se pueden validar dos días después de la transfección mediante microscopía. Es inusual trabajar con células de dictyostelio y suspensión de bacterias. La visualización ayudará a dar a los experimentadores una idea de cómo se realizan los diferentes pasos de los protocolos.
Demostrar el procedimiento conmigo será Soudabeh Imanikia, un postdoctorado de mi laboratorio. Para empezar, preparar 1000 mililitros de solución de trabajo de soensen tampón con cloruro de magnesio y cloruro de calcio de acuerdo con el protocolo de texto. Después de esto, utilice una sola colonia de K aerogenes para inocular un litro de medio LB.
Permita que las bacterias crezcan durante la noche a 37 grados centígrados con temblores. Gire las células hacia abajo en dos tubos centrífugos de 500 mililitros para cosechar las células. Luego, lave las bacterias una vez con 500 mililitros de tampón.
Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón. Utilice un fotómetro para comprobar la densidad óptica de la muestra y diluir la muestra con búfer hasta que la densidad óptica sea de aproximadamente 100. Después de esto, prepare el búfer de electroporación H40 de acuerdo con el protocolo de texto.
Crecer K aerogenes para confluir un medio SM durante la noche a temperatura ambiente. Añadir 400 microlitros de suspensión bacteriana a una placa de agar SM y extenderlo uniformemente. Luego, tome un lazo estéril e inocularlo con células de dictyostelio y extienda las células en un borde de la placa.
Incubar la placa a 22 grados centígrados durante dos días, para asegurar que las zonas de crecimiento sean lo suficientemente grandes para la transfección. Agregue 10 mililitros de suspensión de a aerogene K a un plato de Petri tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros. A continuación, utilice un bucle de inoculación desechable de 10 microlitrotros para raspar las células de las zonas de crecimiento de la placa de cultivo.
Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros, que contiene un tampón H40 helado. Gire las células durante dos segundos a 10000 veces la gravedad. A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend las celdas en el búfer H40.
A continuación, agregue 100 microlitros de las células a un tubo que contenga de uno a dos microgramos de ADN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transferir la mezcla de ADN celular a una cubeta de electroporación preenfriada. No añada más de dos microgramos de ADN.
Una mayor concentración de ADN es tóxica para las células y reduce la eficiencia. Después de la electroporación, transfiera inmediatamente las células a una placa Petri preparada de 10 centímetros y permita que las células se recuperen durante cinco horas. Para seleccionar un transfectante para un knock-out, knock-in, o un acto cinco knock-in, separar las células de la placa Petri pipeteando líquido sobre la superficie.
A continuación, configure tres diluciones del agente selectivo de acuerdo con el protocolo de texto. Por último, distribuya 150 microlitros de las diluciones preparadas en cada pocillo de placas de cultivo de tejido plano de 96 pocillos. En este protocolo, se demostró un sistema de plásmido extracromosomico de reportero dual.
32 horas después de la transfección, la mayoría de las células expresaban ambas proteínas fluorescentes de fusión etiquetadas. Un acto cinco M cherry knock-in y un NC4 también se intentó. Se obtuvieron dos bandas después de ejecutar el digestor en un gel de agarosa.
La banda de par base 4127 contiene la construcción deseada. El ADN purificado se utilizó para la transfección de células NC4. Dos clones de la transfección NC4 fueron analizados a través de PCR y ambos mostraron los patrones de banda predichos.
La mancha meridional se utilizó entonces para validar los resultados de la PCR. El NC4 creció más rápido en céspedes bacterianos que las células Ax2. Después de cuatro horas, más de las células NC4 fueron capaces de arrastrarse bajo la agarosa que las células Ax2.
Las células NC4 fueron más rápidas y mostraron una respuesta quimiotáctica más fuerte al folato que las células de Ax2. Utilice siempre las células de las placas SM recién configuradas. Nunca utilice celdas de más de cuatro días, de lo contrario la eficiencia disminuirá.
Las cepas de HAP blancas, recién aisladas y no extensitivas se utilizan comúnmente para abordar preguntas relacionadas con un ruching o comportamiento social de los dictyosteliums. Nuestro permite aplicar la genética molecular a través de esos aislados.
