Der Wert dieses Protokolls ist, dass es es erlaubt, fast jeden Stamm von Dictyostelium-Discoideum durch Molekulargenetik zu manipulieren, unabhängig davon, ob dieser Stamm axenisch im flüssigen Medium wächst oder nicht. Der andere Vorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und einfach ist. Transponieren Sie zu transfekten Zellen mit einem exochromosomalen Plasmid, bevor Sie beginnen, Dikyosteliume zu mischen.
Die Ergebnisse können bereits zwei Tage nach der Transfektion mittels Mikroskopie validiert werden. Es ist ungewöhnlich, mit Dictyostelium-Zellen und Bakterien Suspension zu arbeiten. Die Visualisierung wird den Experimentatoren eine Vorstellung davon vermitteln, wie die verschiedenen Schritte der Protokolle ausgeführt werden.
Demonstrieren das Verfahren mit mir wird Soudabeh Imanikia, ein Postdoc aus meinem Labor sein. Zunächst 1000 Milliliter Sorensen-Puffer-Arbeitslösung mit Magnesiumchlorid und Calciumchlorid nach dem Textprotokoll vorbereiten. Danach verwenden Sie eine einzige Kolonie von K Aerogenes, um einen Liter LB-Medium zu impfen.
Lassen Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln wachsen. Drehen Sie die Zellen in zwei 500 Milliliter Zentrifugenröhren nach unten, um die Zellen zu ernten. Dann waschen Sie die Bakterien einmal mit 500 Milliliter Puffer.
Das Pellet in 20 Milliliter Puffer wieder aufhängen. Verwenden Sie ein Photometer, um die optische Dichte der Probe zu überprüfen und die Probe mit Puffer zu verdünnen, bis die optische Dichte etwa 100 beträgt. Danach bereiten Sie den Elektroporationspuffer H40 entsprechend dem Textprotokoll vor.
Wachsen Sie K-Aerogene, um ein SM-Medium über Nacht bei Raumtemperatur zu konfluken. 400 Mikroliter bakterielle Suspension zu einer SM-Agarplatte geben und gleichmäßig verteilen. Nehmen Sie dann eine sterile Schleife und impfen Sie sie mit Dikyosteliumzellen und verbreiten die Zellen an einem Rand der Platte.
Inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang bei 22 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Wachstumszonen groß genug für die Transfektion sind. Fügen Sie 10 Milliliter K Aerogene Suspension zu einer 10 Zentimeter Gewebe kulturbehandelten Petrischale hinzu. Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter Einweg-Impfschleife, um Zellen aus den Wachstumszonen der Kulturplatte zu kratzen.
Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Rohr, das einen eiskalten H40-Puffer enthält. Drehen Sie die Zellen für zwei Sekunden bei 10000-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie dann den Überstand, und setzen Sie die Zellen im H40-Puffer wieder auf.
Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Zellen in eine Röhre mit ein bis zwei Mikrogramm DNA. Pipette nach oben und unten, um die Zell-DNA-Mischung zu mischen und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette zu übertragen. Fügen Sie nicht mehr als zwei Mikrogramm DNA hinzu.
Eine höhere DNA-Konzentration ist toxisch für die Zellen und reduziert die Effizienz. Nach der Elektroporation die Zellen sofort in eine vorbereitete 10-Zentimeter-Petrischale übertragen und die Zellen für fünf Stunden erholen lassen. Um ein Transfektat für einen Knock-out, ein Knock-in oder einen Akt fünf Einschlag auszuwählen, lösen Sie die Zellen von der Petrischale, indem Sie Flüssigkeit über die Oberfläche pfeifen.
Richten Sie dann drei Verdünnungen des selektiven Agenten gemäß dem Textprotokoll ein. Schließlich verteilen Sie 150 Mikroliter der vorbereiteten Verdünnungen in jeden Brunnen von 96-gut flachen Gewebekulturplatten. In diesem Protokoll wurde ein extrachromosomales Plasmidsystem mit zwei Reportern demonstriert.
32 Stunden nach der Transfektion exprimierte die Mehrheit der Zellen beide fluoreszierend gekennzeichneten Fusionsproteine. Ein Akt fünf M Kirsche Knock-in und ein NC4 wurde auch versucht. Zwei Bänder wurden erhalten, nachdem der Digest auf einem Agarose-Gel ausgeführt wurde.
Das 4127 Basispaarband enthält das gewünschte Konstrukt. Die gereinigte DNA wurde für die Transfektion von NC4-Zellen verwendet. Zwei Klone der NC4-Transfektion wurden über PCR analysiert und beide zeigten die vorhergesagten Bandmuster.
Southern Blot wurde dann verwendet, um die Ergebnisse der PCR zu validieren. Der NC4 wuchs auf bakteriellen Rasenflächen schneller als Ax2-Zellen. Nach vier Stunden konnten mehr NC4-Zellen unter die Agarose kriechen als Ax2-Zellen.
Die NC4-Zellen waren schneller und zeigten eine stärkere chemotaktische Reaktion auf Folat als die Ax2-Zellen. Verwenden Sie immer Zellen aus frisch eingerichteten SM-Platten. Verwenden Sie niemals Zellen, die älter als vier Tage sind, sonst sinkt die Effizienz.
Frisch isolierte, nonextenische, weiße HAP-Stämme werden häufig verwendet, um Fragen zu einem Ruching oder sozialen Verhalten von Dikyosteliumen zu beantworten. Unsere ermöglicht es, Molekulargenetik durch diese Isolate anzuwenden.
