التقنيات التي ترصد عبء البكتيريا والعدلات استجابة في وقت واحد يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في آليات استمرار راثيف أوريوس وفعالية استراتيجيات العلاج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس معلمات متعددة طولياً في مضيف حي طوال مدة العدوى. من المهم جداً أن تظهر أين تضع الجرح على الماوس dorsum، وكيفية استئصال الجلد، وكيفية تلقيح الجرح مع خراج شتايف.
تبدأ عن طريق ذوبان الاحتياد الحيوي ستاف Aureus سلالة من الفائدة من التخزين السلبي 80 درجة مئوية على الجليد. قبل streaking الثقافة على 5٪ طبق من الأبقار agar الدم. لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في صباح اليوم التالي، نقل ثلاثة إلى أربعة مستعمرات فردية من لوحة رثة ستاف إلى مرق الصويا المُربب، أو TSB. تكمل مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول لاحتضان هز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، تمييع 120 ميكرولترات من عينة الثقافة في ستة ملليلتر من TSB.
مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول، لمدة ساعتين حضانة في 37 درجة مئوية، و 200 التناوب في الدقيقة. عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر 0.5، نقل ثلاثة ملليلتر من التعليق البكتيري إلى 10 ملليلتر الجليد الباردة DPBS. بعد تطهير بعناية من البكتيريا الفائقة ، أضف DPBS مبردة إضافية إلى الكريه ، ودوامة البكتيريا التي تم تعليقها بشكل جيد.
بعد الطرد المركزي الثاني، إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على الجليد. للتحقق من تركيز البكتيريا، تمييع بشكل متسلسل 100 ميكرولترات من التعليق البكتيري بمعامل 1 × 10 إلى 4، و 1 × 10 إلى 5، في برنامج تلفزيوني جديد. ولوحة 20 ميكروليتر من كل تخفيف على لوحات آجار الفردية.
بعد حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، عد عدد وحدات تشكيل مستعمرة عن طريق الفحص الإجمالي لحساب تركيز البكتيريا من اليوم السابق. لجرح الجلد الختان من الحيوانات المتلقي، تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدمه، قبل حلق قسم بوصة واحد من اثنين على الجزء الخلفي من الماوس. يمسح بلطف لإزالة أي الشعر الضال.
وتطهير الجلد المكشوف، مع اليود povidone 10 متتابعة، و 70٪ الإيثانول منقوقة تطبيقات الشاش. الانتقال إلى الخارج من وسط المنطقة الجراحية، في نمط حلزوني. بعد السماح للجلد بالجفاف لمدة دقيقة واحدة ، اضغط بقوة على خزعة لكمة معقمة تبلغ ستة ملليمترات في وسط المنطقة الجراحية المعدة.
التواء خزعة لكمة لإنشاء مخطط دائري على الجلد, أن يقطع تماما من خلال أنسجة الجلد, وعلى الأقل قسم واحد من الخطوط العريضة. الحرص على عدم قطع في اللفافة الأساسية أو الأنسجة. ثم استخدام مقص معقمة، والملقط، لقطع من خلال البشرة والأدمة، بعد نمط دائري مطبوع من قبل خزعة لكمة.
بالنسبة للقح المكورات العضوية ، املأ حقنة الأنسولين 28 مع 50 ميكرولترات من المحاقن البكتيرية المُعدة. واستخدم إصبعاً لسحب أدمة الحيوان الجريح إلى الجانب. عقد الحقنة موازية تقريبا للأنسجة، ببطء إدراج الحقنة في الأنسجة حتى يشعر انخفاض مفاجئ في المقاومة.
مشيرا إلى ثقب اللفافة. مع الإبرة وضعت في وسط الجرح، وتسليم ببطء كامل حجم من تلقيح. تأكد من أن اللقح يشكل فقاعة في وسط الجرح ، مع الحد الأدنى من التسرب أو التشتت.
و أزيل الحقنة ببطء من الحيوان ثم ارجع الحيوان إلى قفصه مع الحرارة والمراقبة حتى الشفاء التام. بعد الجرح والعدوى ، ويوميًا أثناء التجربة ، ضع الفأر المُجَبَّر في جهاز تصوير الإنارة الحيوية والفلوريس ، مع وجود الجرح مسطح قدر الإمكان.
في برنامج التصوير، حدد الإنارة والصورة كأوضاع التصوير. وينبغي أن يكون وقت التعرض مسبقا إلى دقيقة واحدة في binning الصغيرة، F / إيقاف 1 للإنارة، F / إيقاف 8 للتصوير الفوتوغرافي، ومفتوحة لتصفية الانبعاثات. ثم انقر فوق الحصول على ، لتسجيل الصورة.
للتصوير الفلوري في الجسم الحي، حدد الفلوريسنس، والصورة، كأوضاع التصوير. وينبغي أن يكون وقت التعرض مسبقا لثانية واحدة في binning الصغيرة، F / إيقاف 1 لفلوريسنس، F / إيقاف 8 للتصوير الفوتوغرافي، وأطوال موجية الانبعاثات من 465 أكثر من 30 نانومتر، و 520 أكثر من 20 نانومتر، مع كثافة مصباح عالية، على التوالي. ثم انقر فوق الحصول على لتسجيل الصورة.
بعد الحصول على كل من مجموعات من الصور، والعودة إلى الحيوان قفص انها، مع الرصد، حتى الشفاء الكامل. لتحليل الصورة، افتح الصورة ليتم تحديدها كمياً، في برنامج تحليل الصور المناسب، ووضع المنطقة الدائرية الافتراضية ذات الاهتمام على كامل منطقة الجرح بما في ذلك الجلد المحيط. انقر على قياس منطقة الاهتمام، وسجل قيم تدفق متوسط للجرح، للسماح للتدفق المتوسط لكل إشارة أن يتم رسمها مقابل الوقت.
لقياس التئام الجروح، تناسب منطقة دائرية من الفائدة على حافة الجرح، وقياس مساحة الجرح في مربعة سم، للسماح رسم التغيير الكسر من خط الأساس مقابل الوقت. في هذه التجربة التمثيلية، أظهرت العبارة الشرطية EGFP التعبير النخاعي استجابة الأولية 88، أو MyD88 الفئران خروج المغلوب، أكبر قابلية للتطعيم اُريوس 600، مما فعلت غير مشروطة EGFP التعبير عن الحيوانات. مع 80٪ فتاك لوحظ خلال الأيام الثمانية الأولى من العدوى.
كلا سلالات الفئران فقدت ما يقرب من 5٪ من أوزان الجسم على الفور بعد العدوى. ومع ذلك ، فإن EGFP المشروطة التي تعبر عن الفئران استعادت أوزانها الأصلية بحلول اليوم الثاني. في حين أن الفئران MyD88 لم تفعل ذلك.
لم يختلف إغلاق الجروح في وجود عدوى عدوى اُوريوس بين السلالات. ومع ذلك ، أصيب معقمة MyD88 الفئران خروج المغلوب ، وكان عيب كبير في التئام الجروح ، مقارنة مع EGFP مشروط التعبير عن الحيوانات. كشف التصوير الحيواني بأكمله عن عبء بكتيري أعلى ، كما يتضح من زيادة إشارة الإضاءة الحيوية في جروح الحيوانات خروج المغلوب MyD88 ، مقارنة بالحيوانات الشرطية التي تعبر عن EGFP.
ولوحظ أيضا انخفاض بنسبة 40٪ في الاتجار العدلات الأولية للجروح غير المصابة من MyD88 الحيوانات بالضربة القاضية، مقارنة مع EGFP مشروط التعبير عن الحيوانات. عندما 1 × 10 إلى مستعمرة 7 تشكيل وحدات من Staph aureus أدخلت مباشرة بعد الجرح، تم تخفيف الاتجار العدلات بشكل كبير في الحيوانات خروج المغلوب بالمقارنة مع EGFP مشروط التعبير عن الحيوانات. قبل الاستغناء عن البكتيريا ، تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة ، وأن موقع الإبرة يتم وضعه بشكل صحيح في وسط الجرح.
ويمكن حصاد الأنسجة الحيوانية عند نقطة النهاية لقياس التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام ونشر البكتيريا من الجرح. المكورات الآورية المعدية للبشر. على هذا النحو، ينبغي ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع البكتيريا، وينبغي توخي الحذر، عند التعامل مع حقنة تحتوي على مسببات الأمراض.
وقد ساعدت هذه التقنية في استكشاف استخدام العلاجات البيولوجية لعدوى ستاف أوريوس التي تعزز الاستجابة المناعية الفطرية المضيفين ضد العدوى.
