Bakteri yükünü ve nötrofil inkişacını aynı anda izleyen teknikler, Staph aureus kalıcılığının mekanizmaları ve tedavi stratejilerinin etkinliği hakkında bilgi sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, enfeksiyon süresi boyunca canlı bir konakta birden fazla parametrenin uzunlamasına ölçülebiliyor olmasıdır. Yaranın fare dorsuma nereye yerleştirilecek, derinin nasıl çıkarılabildiğini ve yaranın Staph aureus ile nasıl aşılamak için olduğunu göstermek çok önemlidir.
Biyolüminesans Staph aureus'un buz üzerindeki negatif 80 santigrat santigrat deposundan gelen gerilimi eriterek başlayın. Kültürü %5'lik büyükbaş kan agar tabağına almadan önce. 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için.
Ertesi sabah, Staph aureus plakasından üç ila dört ayrı koloniyi tripptik soya suyuna veya TSB'ye aktarın. 37 santigrat derece bir gecede sallayarak kuluçka için kloramfenikol mililitre başına 10 mikrogram ile desteklenmektedir. Ertesi sabah, 120 mikrolitre kültür örneğini altı mililitre TSB'de seyreltin.
Kloramfenikol mililitre başına 10 mikrogram ile, 37 santigrat derece iki saatlik kuluçka için, ve dakikada 200 rotasyon. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,5'e ulaştığında, üç mililitre bakteriyel süspansiyonu 10 mililitre buz gibi DPBS'ye aktarın. Supernatant dikkatle dekanting sonra, pelet ek soğutulmuş DPBS ekleyin ve iyice yeniden askıya bakteri girdap.
İkinci bir santrifüjden sonra, bakteriyel peleti 1,5 mililitre pBS'lik buz üzerinde yeniden askıya alın. Bakteri konsantrasyonu doğrulamak için, seri 4 1 x 10 bir faktör ile bakteri süspansiyon 100 mikrolitre seyreltmek ve 1 x 10 5, taze PBS. Ve her bir agar plakası üzerinde her seyreltme plaka 20 mikrolitre.
37 santigrat derece bir gecede kuluçka sonra, önceki gün bakteri konsantrasyonu hesaplamak için brüt muayene ile koloni oluşturan birimlerin sayısını saymak. Alıcı hayvanların eksizyonel deri yarası için, farenin arka tarafında bir çift inç bölüm tıraş önce, parmak çimdik yanıt eksikliği onaylamak. Herhangi bir sokak kıllarını çıkarmak için hafifçe silin.
Ve ardışık% 10 povidon iyot ile maruz kalan cilt dezenfekte, ve 70% etanol gazlı bez uygulamaları batırılmış. Cerrahi alanın merkezinden dışarı doğru hareket eden spiral bir desen. Cildin yaklaşık bir dakika kurumasını sağladıktan sonra, hazırlanan cerrahi alanın ortasında steril altı milimetrelik bir yumruğuna sıkıca basın.
Twist yumruk biyopsi cilt üzerinde dairesel bir anahat oluşturmak için, bu tamamen cilt dokusu ile keser, ve anahat en az bir bölümü. Altta yatan fasya veya doku kesmek için değil özen. Sonra steril makas kullanın, ve forceps, epidermis ve dermis ile kesmek için, yumruk biyopsi sizler tarafından baskılı dairesel desen aşağıdaki.
Staph aureus aşısı için, hazırlanan biyolüminesans bakteriyel inokülant 50 mikrolitre ile 28 gauge insülin şırınga doldurun. Ve yaralı hayvanın dermisini kenara çekmek için parmağınızı kullan. Şırıngayı dokuya neredeyse paralel tutarak, direncinde ani bir azalma hissedene kadar şırıngayı yavaşça dokuya takın.
Fasyapiercing gösteren. Yaranın ortasına yerleştirilen iğne ile, yavaşça inokülan tüm hacmi teslim. Inokülenin yaranın merkezinde en az sızıntı veya dağılımla bir kabarcık oluşturduğundan onaylayın.
Ve şırıngayı hayvandan yavaşça çıkarın. Sonra tam iyileşme kadar ısı ve izleme ile kafese hayvan dönün. Yaralama ve enfeksiyon dan sonra, ve deney sırasında günlük, bir biyolüminesans ve floresan görüntüleyici içinde anestezili fare yerleştirin, yara mümkün olduğunca düz.
Görüntüleyici yazılımında, görüntüleme modları olarak parlaklık ve fotoğraf seçin. Pozlama süresi küçük binning bir dakika, Parlaklık için F /Stop 1, fotoğraf için F /Stop 8 ve emisyon filtresi için açık önceden ayarlanmış olmalıdır. Ardından görüntüyü kaydetmek için acquire'e tıklayın.
In vivo floresan görüntüleme için, görüntüleme modları olarak floresan ve fotoğraf seçin. Pozlama süresi küçük binning bir saniye için önceden ayarlanmış olmalıdır, F / Stop 1 floresan için, F / Stop 8 fotoğraf için, ve Uyarma ve Emisyon dalga boyları 465 üzerinde 30 nanometre, ve 520 üzerinde 20 nanometre, yüksek lamba yoğunluğu ile, sırasıyla. Ardından resmi kaydetmek için edinme'yi tıklatın.
Her iki görüntü kümesini de elde ettikten sonra, hayvanı tam iyileşmeye kadar izleyerek kafesine geri döndürün. Görüntü analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programında sayısallaştırılacak görüntüyü açın ve varsayılan dairesel ilgi alanını çevredeki cilt de dahil olmak üzere tüm yara alanının üzerine yerleştirin. İlgi bölgesini ölçü'ye tıklayın ve her sinyalin ortalama akının zamana göre çizilmesine izin vermek için yaranın ortalama akısı değerlerini kaydedin.
Yara iyileşmesini ölçmek için, yara kenarına dairesel bir ilgi bölgesi sığdırın ve yaranın alanını santimetre kare şeklinde ölçün, taban çizgisinden zamana göre kısmi değişimin çizilmesine izin verin. Bu temsili deneyde, koşullu EGFP ekspresyonu miyeloid farklılaşma primer yanıtı 88, Veya MyD88 nakavt fareler, Staph aureus aşısı için daha büyük bir duyarlılık gösterdi, olmayan koşullu EGFP ifade hayvanlar yaptı. Enfeksiyonun ilk sekiz gününde %80 ölümcüllük gözlenir.
Her iki fare türü de enfeksiyondan hemen sonra vücut ağırlıklarının yaklaşık %5'ini kaybetti. Ancak, koşullu EGFP fareler ifade gün iki orijinal ağırlıkları kurtarıldı. MyD88 fareler değil iken.
Staph aureus enfeksiyonu varlığında yara kapanması iki suş arasında farklı değildi. Ancak, steril yaralı MyD88 nakavt fareler, yara iyileşmesi önemli bir kusur vardı, koşullu EGFP hayvanları ifade göre. Tüm hayvan görüntüleme daha yüksek bir bakteriyel yük ortaya, MyD88 nakavt hayvanların yaralarında artan biyolüminesans sinyal kanıtlandı, koşullu EGFP hayvanları ifade göre.
MyD88 nakavt hayvanların enfekte olmayan yaralar için ilk nötrofil ticaretinde% 40 azalma, ayrıca koşullu EGFP hayvanları ifade göre gözlendi. Staph aureus'un 7. Bakterileri dağıtmadan önce, şırıngada hava kabarcıkları olmadığından ve iğnenin yerinin yaranın ortasına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
Hayvan dokuları, ilgi ve yara bakteriyel yayma proteinlerin ekspresyonunu ölçmek için son noktada hasat edilebilir. Staph aureus insanlar için bulaşıcıdır. Bu nedenle, kişisel koruyucu ekipman bakteri işleme giyilmelidir, ve dikkatli egzersiz yapılmalıdır, patojen içeren bir şırınga kullanırken.
Bu teknik enfeksiyona karşı konaklar doğuştan bağışıklık yanıtı geliştirmek Staph aureus enfeksiyonları için biyolojik tedavilerin kullanımını keşfetmek yardımcı oldu.
