Las técnicas que monitorean la carga bacteriana y un neutrófilo responden simultáneamente pueden proporcionar información sobre los mecanismos de persistencia de Staph aureus y la eficacia de las estrategias de tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que múltiples parámetros se pueden medir longitudinalmente en un huésped vivo durante toda la duración de la infección. Es fundamental mostrar dónde colocar la herida en un dorso de ratón, cómo extirpar la piel y cómo inocular la herida con Staph aureus.
Comience descongelando la bioluminiscencia Estafilocoa aureus cepa de interés de almacenamiento negativo de 80 grados Celsius en hielo. Antes de rayar el cultivo en un plato de agar sangre bovino del 5%. Para una incubación nocturna a 37 grados centígrados.
A la mañana siguiente, transfiera de tres a cuatro colonias individuales del plato Staph a aureus al caldo de soja tríptico, o TSB. Suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol para una incubación de temblores durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, diluir 120 microlitros de muestra de cultivo en seis mililitros de TSB.
Con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol, para una incubación de dos horas a 37 grados celsius, y 200 rotaciones por minuto. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,5, transfiera tres mililitros de suspensión bacteriana a 10 mililitros DPBS helados. Después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, agregue DPBS refrigerado adicional al pellet, y vórtice las bacterias re-suspendidas a fondo.
Después de una segunda centrifugación, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1,5 mililitros de PBS sobre hielo. Para verificar la concentración de bacterias, diluir en serie 100 microlitros de la suspensión bacteriana por un factor de 1 x 10 a la 4a, y 1 x 10 a la 5a, en PBS fresco. Y placa 20 microlitros de cada dilución en placas de agar individuales.
Después de una incubación durante la noche a 37 grados centígrados, cuente el número de unidades formadoras de colonias mediante un examen bruto para calcular la concentración bacteriana del día anterior. Para heridas de la piel por escisión de los animales receptores, confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo. Limpie suavemente para eliminar los pelos perdidos.
Y desinfectar la piel expuesta, con 10%yodo de povidona secuencial, y 70%aplicaciones de gasa empapada de etanol. Moviéndose hacia afuera desde el centro del área quirúrgica, en un patrón espiral. Después de permitir que la piel se seque durante aproximadamente un minuto, presione firmemente una biopsia de punzón estéril de seis milímetros en el centro del área quirúrgica preparada.
Gire la biopsia de punzonado para crear un contorno circular en la piel, que corte completamente el tejido de la piel y al menos una sección del contorno. Teniendo cuidado de no cortar en la fascia o tejido subyacente. Luego usa tijeras estériles, y fórceps, para cortar la epidermis y la dermis, siguiendo el patrón circular impreso por la biopsia de punzón.
Para la inoculación de estafilococo, llene una jeringa de insulina de calibre 28 con 50 microlitros del inoculante bacteriano bioluminiscente preparado. Y usa un dedo para tirar de la dermis del animal herido a un lado. Sosteniendo la jeringa casi paralela al tejido, inserte lentamente la jeringa en el tejido hasta que se sienta una disminución repentina de la resistencia.
Indicando perforación de la fascia. Con la aguja colocada en el centro de la herida, entregue lentamente todo el volumen del inoculante. Confirme que el inoculante forma una burbuja en el centro de la herida, con una fuga o dispersión mínima.
Y retire la jeringa lentamente del animal. A continuación, devolver el animal a su jaula con calor y monitoreo hasta la recuperación completa. Después de la herida y la infección, y diariamente durante el experimento, coloque el ratón anestesiado en un imágenes bioluminiscente y de florescencia, con la herida lo más plana posible.
En el software imager, seleccione luminiscencia y fotografía como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preestablecerse en un minuto en binning pequeño, F/Stop 1 para luminiscencia, F/Stop 8 para fotografía y abierto para el filtro de emisión. A continuación, haga clic en adquirir para grabar la imagen.
Para imágenes de fluorescencia in vivo, seleccione fluorescencia y fotografíe, como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preestablecerse a un segundo en binning pequeño, F/Stop 1 para fluorescencia, F/Stop 8 para fotografía y longitudes de onda de excitación y emisión de 465 sobre 30 nanómetros, y 520 sobre 20 nanómetros, con una alta intensidad de lámpara, respectivamente. A continuación, haga clic en adquirir para grabar la imagen.
Después de obtener ambos conjuntos de imágenes, devolver el animal a su jaula, con monitoreo, hasta la recuperación completa. Para el análisis de imágenes, abra la imagen que se va a cuantificar, en un programa de software de análisis de imágenes adecuado, y coloque la región circular predeterminada de interés sobre toda el área de la herida, incluida la piel circundante. Haga clic en Medir la región de interés y registre los valores del flujo medio de la herida, para permitir que el flujo medio de cada señal se trace frente al tiempo.
Para medir la cicatrización de la herida, ajuste una región circular de interés sobre el borde de la herida y mida el área de la herida en centímetros al cuadrado, para permitir el trazado del cambio fraccionario desde el valor basal frente al tiempo. En este experimento representativo, la expresión condicional de EGFP mieloid respuesta primaria 88, o ratones noqueados MyD88, demostró una mayor susceptibilidad a la inoculación de Staph aureus, que la expresión de animales no condicional EGFP. Con un 80% de letalidad observado durante los primeros ocho días de infección.
Ambas cepas de ratones perdieron aproximadamente el 5% de su peso corporal inmediatamente después de la infección. Sin embargo, el EGFP condicional que expresaba ratones recuperó sus pesos originales en el segundo día. Mientras que los ratones MyD88 no lo hicieron.
El cierre de la herida en presencia de la infección por Estafilococo no fue diferente entre las dos cepas. Sin embargo, los ratones myD88 noqueadores heridos estérilmente.tenían un defecto significativo en la cicatrización de heridas, en comparación con los animales que expresan EGFP condicionalmente. Las imágenes de animales enteros revelaron una mayor carga bacteriana, como lo demuestra un aumento de la señal bioluminiscente en las heridas de los animales noqueados MyD88, en comparación con los animales que expresan EGFP condicionalmente.
También se observó una disminución del 40% en el tráfico inicial de neutrófilos a heridas no infectadas de animales noqueados de MyD88, en comparación con los animales de expresión de EGFP condicionales. Cuando se introdujeron de 1 x 10 a la 7a colonia unidades formadoras de Staph aureus inmediatamente después de las heridas, el tráfico de neutrófilos se atenió significativamente en animales noqueados en comparación con los animales que expresaban la EGFP condicional. Antes de dispensar las bacterias, asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa y de que la ubicación de la aguja esté correctamente colocada en el centro de la herida.
Los tejidos animales se pueden cosechar en el punto final para medir la expresión de proteínas de interés y la diseminación bacteriana de la herida. El estafilococo aureus es infeccioso para los humanos. Como tal, se debe usar equipo de protección personal al manipular las bacterias, y se debe tener precaución al manipular una jeringa que contenga el patógeno.
Esta técnica ha ayudado a explorar el uso de tratamientos biológicos para las infecciones por Staph aureus que mejoran la respuesta inmune innata de los huéspedes contra la infección.
