Técnicas que monitoram a carga das bactérias e um neutrófilo respondem simultaneamente podem fornecer insights sobre os mecanismos da persistência do Estafilococo e a eficácia das estratégias de tratamento. A principal vantagem desta técnica é que múltiplos parâmetros podem ser medidos longitudinalmente em um hospedeiro ao vivo durante toda a duração da infecção. É fundamental mostrar onde colocar a ferida em um dorso de rato, como extircular a pele, e como vacinar a ferida com Staph aureus.
Comece descongelando a variedade de interesse do Estafáfi aureus de bioluminescência a partir do armazenamento negativo de 80 graus Celsius no gelo. Antes de estriar a cultura em um prato de ágar de sangue bovino de 5%. Para uma incubação noturna a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, transfira três para quatro colônias individuais da placa de Aureus estafilococos para o caldo de soja tptic, ou TSB. Complementado com 10 microgramas por mililitro de clororamfenicol para uma incubação de agitação durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, diluir 120 microliters de amostra de cultura em seis mililitros de TSB.
Com 10 microgramas por mililitro de clororamfenicol, para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius, e 200 rotações por minuto. Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,5, transfira três mililitros de suspensão bacteriana para 10 mililitros de DPBS gelados. Depois de decantar cuidadosamente o supernasce, adicione DPBS refrigerado adicional à pelota e o vórtice das bactérias re-suspensas completamente.
Após uma segunda centrifugação, suspenda a pelota bacteriana em 1,5 mililitros de PBS no gelo. Para verificar a concentração de bactérias, diluir em série 100 microliters da suspensão bacteriana por um fator de 1 x 10 para o 4º, e 1 x 10 para o 5º, em PBS fresco. E placa 20 microliters de cada diluição em placas de ágar individuais.
Após uma incubação noturna a 37 graus Celsius, conte o número de unidades formadoras de colônias por exame bruto para calcular a concentração bacteriana do dia anterior. Para ferimentos de pele excisional dos animais receptores, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, antes de raspar uma seção de uma a duas polegadas na parte de trás do camundongo. Limpe suavemente para remover os cabelos perdidos.
E desinfetar a pele exposta, com iodo sequencial de 10%, e aplicações de gaze encharcada de 70% de etanol. Movendo-se para fora do centro da área cirúrgica, em um padrão espiral. Depois de permitir que a pele seque por cerca de um minuto, pressione firmemente uma biópsia estéril de seis milímetros no centro da área cirúrgica preparada.
Torça a biópsia do soco para criar um contorno circular na pele, que corta completamente o tecido da pele, e pelo menos uma seção do contorno. Tomando o cuidado de não cortar a fáscia ou tecido subjacente. Em seguida, use uma tesoura estéril, e fórceps, para cortar a epiderme e a derme, seguindo o padrão circular impresso pela biópsia do soco.
Para a inoculação de aureus estafilococos, encha uma seringa de insulina de 28 bitolas com 50 microliters do inoculante bacteriano bioluminescente preparado. E use um dedo para puxar a dermis do animal ferido para o lado. Segurando a seringa quase paralela ao tecido, insira lentamente a seringa no tecido até que uma diminuição repentina da resistência seja sentida.
Indicando piercing da fáscia. Com a agulha colocada no centro da ferida, entregue lentamente todo o volume do inoculante. Confirme se o inoculante forma uma bolha no centro da ferida, com vazamento mínimo ou dispersão.
E remova a seringa lentamente do animal. Em seguida, devolva o animal para sua gaiola com calor e monitoramento até a recuperação completa. Após ferimentos e infecções, e diariamente durante o experimento, coloque o rato anestesiado em um bioluminescente e florescence imager, com a ferida o mais plana possível.
No software imager, selecione luminescência e fotografia como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para um minuto em binning pequeno, F/Stop 1 para luminescência, F/Stop 8 para fotografia e aberto para o filtro de emissão. Em seguida, clique em adquirir, para gravar a imagem.
Para imagens de fluorescência in vivo, selecione fluorescência e fotografia, como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para um segundo em binning pequeno, F/Stop 1 para fluorescência, F/Stop 8 para fotografia, e comprimentos de onda excitação e emissão de 465 sobre 30 nanômetros, e 520 sobre 20 nanômetros, com uma lâmpada de alta intensidade, respectivamente. Em seguida, clique em adquirir para gravar a imagem.
Após a obtenção de ambos os conjuntos de imagens, devolva o animal para sua gaiola, com monitoramento, até a recuperação completa. Para análise de imagem, abra a imagem a ser quantificada, em um programa de software de análise de imagem apropriado, e coloque a região circular padrão de interesse sobre toda a área da ferida, incluindo a pele circundante. Clique em medir a região de interesse e regissore os valores para o fluxo médio da ferida, para permitir que o fluxo médio de cada sinal seja plotado versus o tempo.
Para medir a cicatrização da ferida, coloque uma região circular de interesse sobre a borda da ferida, e meça a área da ferida em centímetros quadrados, para permitir a plotagem da mudança fracionária da linha de base versus o tempo. Neste experimento representativo, a expressão EGFP condicional resposta primária de diferenciação 88, ou MyD88 ratos nocautes, demonstrou maior suscetibilidade à inoculação de estafilococos, do que animais expressos não condicionalmente EGFP. Com uma letalidade de 80% observada durante os primeiros oito dias de infecção.
Ambas as cepas de camundongos perderam aproximadamente 5% de seus pesos corporais imediatamente após a infecção. No entanto, os camundongos expressos egfp condicional recuperaram seus pesos originais no segundo dia. Enquanto os ratos MyD88 não.
O fechamento da ferida na presença da infecção por Estafilococos não foi diferente entre as duas cepas. No entanto, camundongos de nocaute MyD88 estéril, apresentaram um defeito significativo na cicatrização de feridas, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Imagens animais inteiras revelaram uma maior carga bacteriana, como evidenciado por um aumento do sinal bioluminescente nas feridas de animais de nocaute MyD88, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP.
Também foi observada uma redução de 40% no tráfico inicial de neutrófilos para feridas não infectadas de animais de efeito de myd88, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Quando 1 x 10 à 7ª colônia formando unidades de Staph aureus foram introduzidas imediatamente após o ferimento, o tráfico de neutrófilos foi significativamente atenuado em animais de nocaute em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Antes de dispensar as bactérias, certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa, e que a localização da agulha esteja corretamente posicionada no centro da ferida.
Os tecidos animais podem ser colhidos no ponto final para medir a expressão de proteínas de interesse e disseminação bacteriana da ferida. Staph aureus é contagioso para os humanos. Como tal, os equipamentos de proteção individual devem ser usados ao manusear as bactérias, e deve-se ter cuidado ao manusear uma seringa contendo o patógeno.
Esta técnica ajudou a explorar o uso de tratamentos biológicos para infecções por Estafilococos aureus que aumentam a resposta imune inata dos hospedeiros contra a infecção.
