Методы, которые контролируют бремя бактерий и нейтрофил реагировать одновременно может обеспечить понимание механизмов стойкости золотистого стафилококка и эффективность стратегий лечения. Основным преимуществом этого метода является то, что несколько параметров могут быть измерены продольно в живом хозяине на протяжении всей инфекции. Очень важно показать, где разместить рану на мышеловку, как подакцизировать кожу, и как привить рану золотом стафилококка.
Начните с оттаивания биолюминесценции золотистого стафилококка штамм интереса от отрицательных 80 градусов по Цельсию хранения на льду. Перед полосами культуры на 5%бычьей крови агар пластины. Для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию.
На следующее утро перенесите три-четыре отдельные колонии из тарелки золотистого стафилококка в триптический соевый бульон, или TSB. Дополняется 10 микрограммами на миллилитр хлорамфеникол для ночного встряхивания инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующее утро разбавляют 120 микролитров образца культуры в шести миллилитров TSB.
С 10 микрограммами на миллилитр хлорамфеникол, в течение двух часов инкубации при 37 градусах по Цельсию и 200 вращений в минуту. Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигает 0,5, перенесите три миллилитров бактериальной суспензии в 10 миллилитров ледяного DPBS. После тщательного декантирования супернатанта, добавить дополнительные охлажденные DPBS к грануле, и вихрь повторно приостановленных бактерий тщательно.
После второй центрифугации, повторно приостановить бактериальные гранулы в 1,5 миллилитров PBS на льду. Для проверки концентрации бактерий, последовательно разбавляют 100 микролитров бактериальной суспензии в 1 х 10 до 4, и 1 х 10 до 5, в свежем PBS. И пластины 20 микролитров каждого разбавления на отдельных агарных пластинах.
После ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию подсчитайте количество колонийообразующих единиц путем валового обследования для расчета бактериальной концентрации по отношению к предыдущему дню. Для excisional кожи ранив животных-реципиентов, подтвердить отсутствие реакции на щепотку ноша, прежде чем бритье один на два дюйма раздел на задней части мыши. Аккуратно протрите, чтобы удалить любые бродячие волосы.
И дезинфицировать открытые кожи, с последовательными 10%povidone йода, и 70% этанола пропитанной марли приложений. Перемещение наружу из центра хирургической области, по спиральной схеме. После того, как кожа высохнет в течение одной минуты, твердо нажмите стерильные шесть миллиметров пунш биопсии в центре подготовленной хирургической области.
Твист пунш биопсии, чтобы создать круговой контур на коже, что полностью прорезает ткани кожи, и по крайней мере один раздел контура. Забота, чтобы не нарезать в основной фасции или ткани. Затем используйте стерильные ножницы и типсы, чтобы прорезать эпидермис и дерму, следуя круговой схеме, запечатленной биопсией пунша.
Для прививки золотистого стафилококка заполните 28-м калибровочным инсулиновым шприцем с 50 микролитров подготовленного биолюминесцентного бактериального инокуланта. И используйте палец, чтобы вытащить дерму раненого животного в сторону. Удерживая шприц почти параллельно ткани, медленно вставьте шприц в ткань до тех пор, пока не будет ощущаться внезапное снижение резистентности.
Указывает на пирсинг фасции. С иглой, помещенной в центр раны, медленно доставить весь объем инокулента. Подтвердите, что инокулент образует пузырь в центре раны, с минимальной утечкой или дисперсией.
И медленно снимите шприц с животного. Затем верните животное в клетку с теплом и мониторингом до полного выздоровления. После раны и инфекции, и ежедневно во время эксперимента, поместите анестезировализованную мышь в биолюминесцентных и флоресца изображения, с раной как можно более плоским.
В программном обеспечении изображения выберите люминесценцию и фотографию в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть задано до одной минуты при небольшом биннинге, F/Stop 1 для люминесценции, F/Stop 8 для фотографии и открыто для фильтра выбросов. Затем нажмите приобрести, чтобы записать изображение.
Для визуализации флуоресценции in vivo выберите флуоресценцию и фотографию в качестве режимов визуализации. Время экспозиции должно быть задано до одной секунды при небольшом биннинге, F/Stop 1 для флуоресценции, F/Stop 8 для фотографии, и Возбуждение и Выброс длин волн 465 более 30 нанометров, и 520 более 20 нанометров, с высокой интенсивностью лампы, соответственно. Затем нажмите приобрести, чтобы записать изображение.
После получения обоих наборов изображений, вернуть животное в клетку, с мониторингом, до полного выздоровления. Для анализа изображений откройте изображение для количественной оценки в соответствующей программе анализа изображений и поместите круговую область интереса по умолчанию по всей области раны, включая окружающую кожу. Нажмите измерить область интереса, и записывать значения для среднего потока для раны, чтобы средний поток каждого сигнала, которые будут построены по сравнению со временем.
Для измерения заживления раны, подходят круговой области интереса над краем раны, и измерить площадь раны в сантиметрах в квадрате, чтобы заговор дробных изменения от базового по сравнению со временем. В этом репрезентативном эксперименте, условное выражение EGFP миелоидной дифференциации первичного ответа 88, или MyD88 нокаут мышей, продемонстрировали большую восприимчивость к прививке золотистого стафилококка, чем сделал неусловный EGFP выражения животных. При 80%летальности наблюдается в течение первых восьми дней инфекции.
Оба штамма мышей потеряли около 5% веса тела сразу после заражения. Тем не менее, условный EGFP выражая мышей восстановили свои первоначальные веса на второй день. В то время как myD88 мышей нет.
Закрытие раны в присутствии инфекции золотистого стафилококка не отличалось между двумя штаммами. Тем не менее, стерильно ранены MyD88 нокаутом мышей, был значительный дефект в заживлении ран, по сравнению с условными EGFP выражения животных. Целая визуализация животных выявила более высокую бактериальную нагрузку, о чем свидетельствует повышенный биолюминесцентный сигнал в ранах нокаутирующих животных MyD88, по сравнению с условным EGFP, выражают животных.
40%снижение первоначального оборота нейтрофилов для неинфицированных ран MyD88 нокаут животных, также наблюдается по сравнению с условным EGFP выражения животных. Когда 1 х 10 до 7-й колонии формирования единиц стафилококка золотия были введены сразу после ранения, нейтрофил торговли был значительно затуманен в нокаут животных по сравнению с условным EGFP выражения животных. Прежде чем обойтись без бактерий, убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха, и что расположение иглы правильно расположено в центре раны.
Ткани животных могут быть собраны в конечной точке для измерения экспрессии белков, представляющих интерес и бактериального распространения из раны. Золота стафилококка заразна для человека. Таким образом, средства индивидуальной защиты следует носить при обращении с бактериями, и осторожность должна проявляться, при обработке шприца, содержащего патоген.
Этот метод помог изучить использование биологических методов лечения стафилококковых инфекций золотистого происхождения, которые повышают хозяев врожденный иммунный ответ против инфекции.
