يساعد بروتوكولنا المحققين على تنفيذ خطوط الأنابيب التجريبية الموحدة لأداء توصيف الظاهريات للسكان المماثلين عن طريق التلطيخ المناعي. مع هذه التقنية، يمكن للباحثين تحليل دقيق التركيبة المماثلة للأنسجة المرض المعقدة وإجراء التحليلات النوعية والكمية من الأنماط الظاهرية لأنواع الخلايا من الفائدة. إثبات الإجراء سيكون (سيدني ماهان)، فني من مختبري.
لإعداد الحيوان لحصاد الشريان brachiocephalic ، قطع الصفاق حتى القص ، مع الحرص على عدم تلف أنسجة البطن. و إجراء جرحين عند خط منتصف الإبط من خلال الصدر مع الحرص على عدم إتلاف القلب والرئتين ثم، قطع الحجاب الحاجز لفضح جزئيا القلب.
لإسراف الماوس، تثبيت نظام الثقل بغزارة بحيث ضغط السائل غزير ما يعادل متوسط ضغط الدم مورين للسماح بغزارة متسقة وصيانة مورفولوجيا السفينة. ثم، وافرح الحيوان مع خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة PBS، 10 ملليلتر من 4٪ درجة حرارة الغرفة شبه شكلي، وخمسة ملليلتر إضافية من درجة حرارة الغرفة PBS. قم بتوصيل إبرة فراشة قياس 23 أو 25 بنظام الإسراف في الجاذبية، وادير برنامج PBS من خلال الإبرة لطرد الهواء من الأنابيب قبل إدخال الإبرة في البطين الأيسر.
بعد تأمين الإبرة في مكانها، استخدم مقص القزحية لإجراء شق أقل من سنتيمترين في الأذين الأيمن. حصاد الأنسجة ذات الأهمية في 4٪ paraformaldehyde الطازجة. لفضح الشريان brachiocephalic، استخدم مقص لجعل شق أسفل خط الوسط من القص من خلال مانوبيوم واستخدام ملقط لسحب كلا الجانبين من القفص الصدري لفتح تجويف الصدر تماما.
بعد ذلك ، ضع الحيوان تحت مجهر تشريح لتصور جزئي للغلاف السباتي ، واستخدم ملاقط دقيقة لسحب العضلات والأنسجة الضامة والدهون حتى يتم تنظيف الشريان السباتي ، والشريان الباتني ، والتشعب تحت التفكاني ، والقوس الأبهري وعزله عن الأنسجة الضامة والدهون المحيطة. المقبل، واستخدام ملقط للاستيلاء على السباتي الحق تحت التشعب وجعل قطع الأولية فوق ملقط. ومع ذلك ، عقد السباتي ، وجعل قطع الثانية من خلال الشريان تحت الترف وجعل القطع الأخيرين من خلال القوس الأبهري على جانبي الشريان brachiocephalic.
ثم, جمع أي أنسجة الأوعية الدموية الأخرى من الفائدة ووضع الشريان brachiocephalic والأنسجة الأخرى في 4٪ محلول شبهformaldehyde بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لتلطيخ الشريان الرعشي، استخدم ميكروتوم للحصول على 10 أقسام ميكرومتر من خلال عينة الأنسجة المضمنة في البارافين حتى يمكن تأكيدها عن طريق المجهر الخفيف الذي تم تقسيمه من خلال القوس الأبهري وأن الشريان البرازيليرئخي مرئيًا. ضبط اتجاه الكتلة حتى يتم تعامد الأنسجة تماما على شفرة microtome والحصول على ثلاثة أقسام 10 ميكرومتر سميكة المسلسل من الشريان brachiocephalic في الشريحة الزجاجية، حتى يتم التوصل إلى التشعب تحت التفكيك.
عندما تم جمع جميع الأقسام ، هيدرات عينات الأنسجة تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية مع اثنين من الغمرات الزيلين خمس دقائق ، تليها سلسلة الإيثانول الغمر خمس دقائق على النحو المشار إليه ، واثنين من الغمر المياه ديونيد لمدة خمس دقائق. المقبل، والشرائح احتضان في حل استرجاع المستضد، وفقا للبروتوكولات القياسية، تليها التدفئة في الميكروويف لمدة 20 دقيقة. بعد ساعة واحدة تبرد في درجة حرارة الغرفة، واستخدام قلم للماء لتطويق كل قسم الأنسجة.
ومنع أي ربط غير محددة مع حظر العازلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وتسمية عينات الأنسجة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع مزيج الأجسام المضادة الأولية من الفائدة، أو isotype مطابقة الأجسام المضادة السيطرة IgG. في صباح اليوم التالي، غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل، تليها حضانة ساعة واحدة في الفلوريسين مناسبة تركيب كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية وDAPI للتصور نواة.
ثم، استخدام تركيب المتوسطة مناسبة للمجهر الفلوريسنس لتركيب الأغطية على الشرائح. للتصوير المجهري confocal من أقسام الأنسجة المسمى، استخدم أقسام ملطخة التحكم IgG والأجسام المضادة الأولية لضبط حساسية الكاشف، وقوة الليزر، وعوض لكل قناة على حدة. ثم، تعيين مواضع العلوي والسفلى للحصول على كومة z وتحديد سمك وعدد من أكوام ليكون صورة.
عندما تم الحصول على جميع الصور ، افتح الصور في ImageJ وافتح لوحة أدوات القناة والألوان الزائفة قنوات التلوين المختلفة. دمج قنوات الألوان. يجب أن تصبح جميع القنوات مرئية على نفس الصورة.
قم بتشغيل وإيقاف قنوات الألوان الفردية داخل لوحة أدوات القناة، وانقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة العد لتحديد أداة النقاط المتعددة. انقر نقرًا مزدوجًا على أيقونة العد لفتح لوحة أداة النقاط وتحديد نوع وحجم العناصر المستخدمة في حساب الخلايا. تحقق من إظهار الكل وتشغيل قناة DAPI فقط في لوحة أدوات القناة.
ثم، حدد قناة العداد صفر وانقر على النوى الفردية التي سيتم وضع علامة عليها، التمرير من خلال مداخن ض لحساب كل من النوى الملطخة داخل المنطقة من الفائدة. وسيُشار أدناه في لوحة الأدوات المعنية بعدد الأحداث المحددة كمياً في خلية واحدة. عندما تم وضع علامة على جميع النوى ، قم بتشغيل قناة تلطيخ أخرى وحدد قناة مضادة واحدة لوضع علامة على الخلايا التي يوجد فيها كولوكاليل بين DAPI وتلطيخ الأجسام المضادة.
لتلوين السيتوبلازمي، حدد الخلايا مع تلطيخ المحيطة النواة في جميع أنحاء عمق كامل من النواة، والتحقق من عدة ز مداخن حسب الضرورة. ويمكن بعد ذلك التعبير عن النتائج على أنها عدد الخلايا إلى العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية DAPI، أو عدد الخلايا لكل منطقة داخل المنطقة موضع الاهتمام. يُمكن لتلطين المناعي مع الأجسام المضادة التي تستهدف علامات الظاهريات، كما هو موضح، الحصول على صور لكل تلطيخ علامة فردية وتباين التداخل التفاضلي لتحديد المناطق ذات الأهمية لعد الخلايا المفردة.
يمكن بعد ذلك إجراء العد في خلية واحدة لتحديد وفرة مختلف مجموعات العضلات الملساء المشتقة من الخلايا باستخدام ImageJ. على سبيل المثال، كشف تحليل عد الخلايا المفردة في منطقة الغطاء الليفي لهذه الأقسام العرضية التمثيلية عن اختلافات ملحوظة في التركيب الخلوي لمنطقة الغطاء الليفي بين الفئران المعالجة بالأجسام المضادة المضادة IL-1 beta والفئران المعالجة بتحكم IgG مطابق للأيزوكيب. في الواقع، ارتبط تثبيط IL-1 بيتا مع انخفاض في خلايا العضلات الملساء YFP إيجابية، وزيادة في الخلايا إيجابية galectin-3.
وعلاوة على ذلك، لوحظ انخفاض في عدد YFP إيجابية العضلات الملساء ألفا الأبهري الفعل إيجابية خلايا العضلات الملساء. في حين أن العدد النسبي للعضلات الملساء المستمدة من الخلايا YFP إيجابية جاليكتين-3-الضامة إيجابية زيادة كبيرة في كل من مواقع الشرايين brachiocephalic. وتجدر الإشارة إلى أن تثبيط IL-1 بيتا لم يؤثر على العدد الإجمالي للخلايا النيدروجينية في العظام داخل الآفة، أو نسبة الخلايا التشخرية الملساء في العضلات أو الخلايا التشخرية المشتقة من الضامة.
وقد تم تصميم هذا البروتوكول لتعزيز صرامة وإعادة إنتاج في تحليل آفات تصلب الشرايين من خلال توحيد الخطوات الرئيسية مثل جمع الأنسجة ومعالجتها والقطع، فضلا عن عد الخلايا المفردة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل الأسرة الوعائية الإضافية المعرضة لتقديم آفات تصلب الشرايين بما في ذلك الشريان الأبهر والجذر الأبهري.
