الهدف العام لهذا البروتوكول هو تزويدنا بتكرار كهربائي لتوزيع المياه في أنواع مختلفة من خلايا xylem في الموقع. وقد استخدمت هذه الطريقة لمراقبة المياه في إكسيليّم من أجل توضيح توزيع المياه وتغير نظم المياه، والتباين الموسمي لتوزيع المياه، وأثر دورات التجميد/الذوبان، وتوزيع المياه في الخشب الرطب، والتجويف الناجم عن بعض الضغوط الحيوية. تجميد تثبيت جذع المعيشة تحت ارتفاع التوترات الهيدروليكية يسبب أحيانا التجويف الاصطناعي، والتي لوحظت من قبل بلورات الجليد تمزق في تجويف من قناة.
ويركز هذا الإجراء المحدث على الحصول على صور ميكروغرافية من الإكسيليم بدون أثرية في إجراءات أخذ العينات. إن البرهان العملي أمر بالغ الأهمية لأن هناك عددا من التفاصيل الهامة التي لا يمكن تفسيرها بسهولة. وفي الوقت نفسه، فإن الحصول على التدريب ليس سهلاً لأن عدداً قليلاً فقط من المختبرات في جميع أنحاء العالم تمارس هذه الطريقة.
للبدء في هذا الإجراء، أرفق فرعًا ويترك لأخذ العينات مع كيس بلاستيكي أسود لتكبيل إمكانات المياه بين إكسيليم ويترك أكثر من ساعتين قبل أخذ العينات. باستخدام غرفة الضغط، وتحديد إمكانات المياه من ما لا يقل عن اثنين من أوراق من العينة. عندما تكون إمكانات المياه أعلى من حوالي ناقص 0.5 ميغاباسكال، يمكن حصاد عينة بعد التجميد.
عندما تكون إمكانات المياه أقل من ناقص 0.5 ميغاباسكالس، والمضي قدما في علاج للاسترخاء. إصلاح طوق محكم حول الجذعية، والتي سيتم ملئها بالماء. باستخدام القصات تقليم أو منشار، وقطع الجذعية تحت سطح الماء والحفاظ على نهاية قطع من العينة تحت الماء.
نقل العينة إلى حاوية أخرى من الماء في أسرع وقت ممكن للحد من تعريض نهاية قطع إلى الهواء. بالنسبة للأنواع ذات الإجازات العريضة، تأكد من أن الطول من البقعة التي سيتم الحصول فيها على عينة التبريد لـ SEM إلى الحافة المقطوعة للسيقان المقطوعة أطول من الحد الأقصى لطول السفينة للعينة من أجل منع القطع الأثرية الناجمة عن التوتر داخل المكملة crysoample. بعد ذلك، قم بتغطية العينة بكيس بلاستيكي أسود لتقليل النتح.
الحفاظ على نهاية قطع من العينة في الماء والحفاظ على هذا الشرط لمدة 30 دقيقة تقريبا من أجل الاسترخاء التوتر xylem. بعد ذلك، قم بقياس إمكانات المياه مرة أخرى لتأكيد تخفيف التوتر xylem. أولاً، استخدم مقص أو سكين فائدة لقطع وفتح جانب واحد من طوق المياه الضيقة.
نعلق طوق بإحكام حول الجذعية مع شريط لاصق في حين عقد الفتحة أفقيا. وضع على قفازات عازلة، وعقد بأمان وعاء من النيتروجين السائل. تشغيل النيتروجين السائل في ذوي الياقات البيضاء حتى يكون كاملا والاحتفاظ بها مملوءة بإضافة النيتروجين السائل باطراد لتجميد المياه في xylem تماما.
بعد وقت التجميد الكافي، فصل طوق من الجزء المجمدة من جذع العينة من أجل إزالة النيتروجين السائل. على الفور استخدام منشار من ناحية غرامة لحصاد العينة. ثم تغطية العينة المجمدة مع قطعة من رقائق الألومنيوم أو وضعه مرة أخرى في أنبوب عينة.
ضع العينة المحصودة بسرعة في حاوية مليئة بالنيتروجين السائل. تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة لأداء الملاحظة. للبدء ، تعيين درجة حرارة غرفة العينة من التبريد إلى ناقص 30 درجة مئوية ، والتي عادة ما تكون باردة بما يكفي للحفاظ على النسغ xylem من معظم النباتات في حالة المجمدة.
استخدام سكين حادة أو منشار غرامة مسننة لتقليم العينة إلى قطعة صغيرة التي يمكن تعديلها لحامل العينة من كريو-SEM. جبل قطعة قلصت إلى تشاك، حامل للتبريد، مع تجميد الأنسجة تضمين المتوسطة لالتجميل التبريد. نعلق تشاك إلى حامل عينة من microtome من التبريد.
تقليم السطح عن طريق الحلاقة مرارا وتكرارا قبالة خمسة إلى سبعة أقسام سميكة ميكرومتر. قطع أكثر من 1،000 إلى 2،000 ميكرومتر في عمق إجمالي إلى السطح الأولي مفيد ل elmininating الجزء التالف من العينة الناجمة عن ما قبل القطع. بعد تقليم سطح العينة تقريبًا، اضبط جزءًا غير مستخدم من شفرة الميكرات فوق سطح العينة.
توسيع قليلا المسافة بين سطح العينة ونصلة. وقطع السطح مرة واحدة فقط أو مرتين. ثم، حرك النصل مرة أخرى ووضع جزء غير مستخدم من النصل على سطح العينة.
كرر هذه المعالجة القطع ثلاث إلى أربع مرات للحصول على سطح واضح دون علامات سكين. بعد القطع النهائي، قم بتعيين موضع النصل بعيدًا عن العينة لمنع الغبار من الالتصاق بالعينة. وفصل تشاك من الدقيقة.
المقبل، إرفاق العينة إلى حامل عينة CRYO-SEM مع الأنسجة تجميد تضمين المتوسطة في غرفة التبريد. أولا، استخدام النيتروجين السائل للحفاظ على درجة حرارة تحت ناقص 120 درجة مئوية في غرفة عينة CRYO-SEM وفقا لدليل المستخدم المعدات. بعد ذلك، ضع حامل العينة مع العينة المعدة في حاوية عازلة مليئة بالنيتروجين السائل في غرفة التبريد.
استخدام قضيب تبادل العينة لعقد حامل العينة تحت النيتروجين السائل. نقل حامل العينة بسرعة إلى غرفة ما قبل الإخلاء من غرفة عينة CRYO-SEM بمجرد البدء في إخلاء غرفة ما قبل الإخلاء. للبدء، بدوره على تسارع الجهد من البندقية الكهربائية.
المقبل، ورفع درجة حرارة مرحلة العينة إلى ناقص 100 درجة مئوية. انتظر عدة دقائق لإزالة غبار الصقيع ومستوى سطح الجليد في خلايا الإكسيليم لتنخفض قليلا مقارنة بجدران الخلية. ثم، وخفض درجة حرارة مرحلة سبيريومن إلى ناقص 120 درجة مئوية.
في هذه الدراسة، يتم استخدام أساليب مراقبة CRYO-SEM لتصور توزيع المياه بوضوح على نطاق خلوي. عند التكبير المنخفض ، تشير المنطقة السوداء في الصور إلى التجاويف التي يختفي منها الماء كليًا أو جزئيًا ، في حين تشير المنطقة الرمادية إلى جدران خلية الإكسيليم ، السيتوبلازم والماء. في التكبير عالية، يصبح من الواضح أن المياه لا تضيع تماما من لومينا من ثلاثة tracheids، مما يدل على حدوث فقاعات الماكرو في النسغ xylem في الموقع.
فيما يتعلق بالأنواع ذات الإجازات الواسعة، يتم اكتشاف حدوث التجويف بسهولة داخل الأوعية، في حين يصعب تمييز وجود المياه داخل الألياف، خاصة عند التكبير المنخفض. يمكن تمييز خلايا السيتوبلازم وparenchyma من الماء داخل tracheids أو السفن من خلال القوام الطائرة الجليد. تحليل تأثير درجة الحرارة على عملية تجميد النقش يكشف عن أن غبار الصقيع يتم تسامي تدريجيا، وأغشية حفرة endotracehid تصبح أكثر وضوحا من خلال تطور التسام مع زيادة درجة الحرارة.
يمكن التخلص من جزيئات غبار الصقيع الكبيرة المتبقية عن طريق المزيد من النقش التجميدي. ولكن هذا يمكن أن يكون مشكلة لأنه يقلل دون داع من مستوى سطح الجليد في قنوات xylem. ويتم تحقيق جودة عالية للمراقبة إلى حد كبير من خلال إعداد العينات الدقيقة.
إن تجانس السطح مع الشفرة الحادة للميكرات الدقيقة مهم بشكل خاص. يمكن أن يؤدي النعيم غير الكافي بواسطة شفرة مستخدمة في بعض الأحيان إلى إنشاء سطح خشن يشبه علامات السكين ، أو يمكن أن يخلق العديد من حوادث الغبار من التخفيضات. تجميد العينة دون الاسترخاء من الضغط عمود المياه السلبية يسبب تحريض artifactual التجويف في قنوات xylem.
ويلاحظ بلورات الجليد المجمعة في السفن من العينات حيث لم تكن العينة استرخاء. وعلى النقيض من ذلك، لا تلاحظ بلورات جليدية متجمعة في عينات العينات المريحة ذات الإمكانات المائية المماثلة. وقد يؤدي تطبيق تثبيت التجميد على النباتات الحية التي تعاني من الجفاف إلى حمل القطع الأثرية القائمة على النتائج مثل بلورات الجليد المتجمعة.
هذه القطع الأثرية تؤدي إلى تفسيرات خاطئة لحالة المياه في قناة xylem. لذلك من المهم أولا التأكد من إمكانات المياه للعينات قبل تثبيت التجميد. على الرغم من أن هذا الإجراء يوفر صورة عن حالة ما في قناة xylem، يجب أن يتم تدمير شجرة حية للمراقبة.
الجمع بين طرق المراقبة الأخرى غير الغازية مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي الجزئي مع مراقبة الصورة على مستوى فرعي سوف يعمق فهمنا للطبيعة بين نقل المياه والاستخدام. كما أن ملاحظة حالة المياه التي أدخلتها هذه الورقة ستوفر طريقة لتوضيح علاقة المياه المختلطة في الخلايا والاستجابات التشريحية الأخرى للإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي. وقد استخدمت Cryo-SEM مجهزة بالطاقة تشتت الأشعة السينية الطيفي أو سيم العلوي لدراسة توزيع عنصر على سطح عينة تحتوي على الماء.
الجمع بين التحليل العنصري وهذا الإجراء في هذا الإطار مماثلة يمكن أن تعطينا معرفة عميقة من سلوك خلية xylem المتعلقة بحالة المياه. عند استخدام النيتروجين السائل لتثبيت تجميد العينات في غرفة، لا تنسى لتهوية الغرفة لتجنب نقص الأكسجين.
