يحسن هذا البروتوكول بشكل كبير التباين بين أنسجة النبات الطفيلي والمضيف في العينات التي سيتم تحليلها باستخدام التصوير المقطعي المجهري. تعمل التقنية الموصوفة هنا على تسريع عملية التروية المتباينة من خلال العينة ، مما يسمح بتحليل أنسجة وهياكل محددة تشكلت بين النبات الطفيلي والمضيف. نهج الفراغ واضح جدا ويجب ألا يقدم أي صعوبات.
من ناحية أخرى ، قد يكون إعداد جهاز التروية صعبا بعض الشيء. لكن الممارسة المسبقة يمكن أن تساعد. بالنسبة للعينات الصغيرة غير الخشبية ، يمكن استخدام طريقة الفراغ للتطبيق.
في حين يجب استخدام طريقة الوفرة للعينات الأكبر حجما والخشبية ، بما في ذلك جزء من جذع أو جذر المضيف. في حالة استخدام طريقة الفراغ ، ضع العينة في القارورة التي تحتوي على المحلول المتناقض. ثم ضع القارورة في غرفة مفرغة أو مجفف متصل بمضخة تفريغ.
قم بإزالة الغطاء من القارورة وأغلق غرفة التفريغ أو المجفف. تأكد من عدم وجود تشققات في غرفة التفريغ أو المجفف. افتح صمام استنفاد الحجرة أو المجفف لإجبار الهواء على الخروج.
قم بتشغيل المضخة وانتظر حتى يصل الضغط إلى حوالي 20 بوصة من الزئبق ، أو 10 رطل / بوصة مربعة. أغلق الحجرة أو صمام العادم المجفف لمنع الهواء من الدخول مرة أخرى. ثم قم بإيقاف تشغيل المضخة بسرعة.
اترك العينة في فراغ لمدة ساعتين على الأقل. في حالة استخدام طريقة الوفرة ، حدد خزان الإمداد وفقا لحجم العينة. بالنسبة للعينات الصغيرة ، يمكن استخدام حقنة 50 ملليلتر بدون إبرة كخزان.
قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب البلاستيكي الشفاف بخزان الإمداد. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر بصمام ثنائي الاتجاه أو ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل أنبوب ثان بمخرج مختلف في الصمام.
قم بتأمين خزان الإمداد في موضع مرتفع دون تفكيك الجهاز الذي تم إعداده في الخطوة السابقة. أغلق الصمام ثلاثي الاتجاهات أو ثنائي الاتجاه لمنع السائل من الخروج من نظام الأنابيب وصب المحلول المتباين في خزان الإمداد. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء كبيرة في نظام الأنابيب وأغلق الصمام مرة أخرى ، واترك الجهاز في مكانه.
لتحضير العينة لوفرة محلول التباين ، احتفظ بها مغمورة في سائل واقطع طرف الطرف القريب من جذع المضيف أو الجذر. افتح الصمام بعناية للسماح للمحلول المتباين بالتدفق ببطء وملء الأنبوب البلاستيكي المتصل بالخزان مع تثبيت الطرف المفتوح للنظام في وضع مرتفع قليلا لمنع انسكاب المحلول المباين. قم بتوصيل الطرف القريب من جذع المضيف أو الجذر في العينة بالطرف المفتوح لنظام الأنابيب.
اترك المحلول يتخلل العينة لمدة ساعتين على الأقل أو حتى يتراكم المحلول داخل الحاوية. أغلق الصمام وافصل العينة بعناية عن الجهاز. اغسل العينة عن طريق غمرها في الماء لمدة دقيقتين.
ضع العينة في منشفة ورقية في درجة حرارة الغرفة للسماح للماء الزائد بالتبخر لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق دون السماح للعينة بالجفاف تماما. لف العينة في فيلم بارافين وتجنب طي الفيلم فوق العينة. يمكن الاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لفهم الهياكل المعقدة للنباتات الطفيلية وتفاعلها مع المضيفين بطريقة ثلاثية الأبعاد غير مدمرة.
تعمل البروتوكولات الموضحة هنا مع أنظمة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المختلفة. ومع ذلك ، تعتمد الإعدادات والمعلمات على النظام والعينات. كانت صور مجهر الأشعة السينية 3D فعالة مثل الأقسام التشريحية التي لوحظت تحت المجهر الضوئي لتحليل تنظيم الأنسجة والطوبولوجيا في واجهة مضيف الطفيلي.
استنادا إلى اختلاف اللون الأبيض الساطع والرمادي الداكن بسبب الامتصاص التفاضلي لمحلول التباين ، من الممكن ملاحظة وفرة الحمة المحيطة بالنواة الوعائية لل haustorium. يمكن ملاحظة النواة الوعائية بسهولة في المقاطع العرضية حيث يتم فصل شريطين وعائيين بواسطة الحمة. أظهر الحد الأدنى من Viscum الطفيلي الداخلي ، الذي ينمو داخل نبات مضيف عصاري ، خلايا حمة تخزن الكربوهيدرات في شكل نشا.
سمح الاختلاف في امتصاص اليود بالكشف عن الشبكة المعقدة للخيوط القشرية التي شكلها الطفيلي الداخلي داخل الجسم المضيف. تساعد النتائج التي تم الحصول عليها ل Cuscuta Americana و Struthantus marcianus في توضيح ملاءمة نهج التصوير المقطعي المجهري للعينات الصغيرة والكبيرة على التوالي. أظهر المقطع التسلسلي الافتراضي لفطريات Sibelium أن الأوعية الموجودة في جذر المضيف تتشعب إلى درنة الطفيلي ، وأن استمرارية نسيج الخشب بين النباتين تتشكل عن طريق الاتصال من وعاء إلى وعاء عبر ألواح التثقيب.
يمكن دمج الإجراء الموصوف هنا مع تقنيات أخرى ، مثل التجزئة الافتراضية ، لتوفير رؤى جديدة حول البنية ثلاثية الأبعاد للاتصال بين النباتات الطفيلية ومضيفيها. مهدت هذه التقنية الطريق لتحليل جوانب مختلفة من بيولوجيا النباتات الطفيلية ، بما في ذلك تطوير الطفيليات الداخلية ووظائف اتصالات الطفيليات المفرطة.
