قياس أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS هو مشكلة معروفة. في هذا الفيديو، سوف نبرهن على القياس القابل للاستنساخ لـ ROS استجابةً لوصلة مستقبلات FC-gamma باستخدام مسابير الفلورسنت والتنظير الكيسي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي إعادة إنتاج المقايسة واستخدام هذه الطريقة مع محفزات محدّدة محددة ، وليس فقط ميتوجين أو محرضات ROS المعروفة.
يعد إنتاج ROS dysregulated أمرًا أساسيًا لتطوير العديد من الأمراض مثل مرض الحبيبات المزمن أو CGD. قياس بدقة يمكن أن تشكل ROS جزء واحد من التشخيص الجزيئي ل CGD. دراسة FC-بوساطة إنتاج ROS مهم في دراسة نقص المناعة, مثل CGD, ولكن أيضا في دراسة أمراض المناعة الذاتية, أو الأمراض العصبية, حيث أن الكثير من روس يؤدي إلى الإجهاد التأ المؤسد والتهاب.
توقيت الفحص أمر بالغ الأهمية. أنصح شخص يحاول هذا البروتوكول للمرة الأولى أن يعد بدقة والقيام بتجربة وهمية إذا كان ذلك ممكنا. المرئية مظاهرة من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية من أجل التأكيد على الخطوات من الفحص التي تحتاج إلى اهتمام خاص مثل توقيت الفحص.
للبدء، قم بإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم باستخدام الوسائط المشروطة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد فتيلة الضامة بين عشية وضحاها، الطامح عظمى وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. المصل تجويع الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع نفس حجم DMEM المصل المنخفض.
لكل فأر، سيتم التعامل مع لوحة واحدة مع المضادة BSA IgG1 في حين أن المصل تجويع بينما سيتم ترك الآخر دون علاج. إضافة دمم المصل منخفضة فقط إلى لوحات غير المعالجة وإضافة DMEM المصل المنخفض التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من مورين المضادة لـ BSA IgG1 إلى لوحات المعالجة. تأكد من تضمين لوحة واحدة غير معالجة إضافية لكل تجربة لتكون بمثابة التحكم في تعويض السيمترات التدفق.
احتضان لوحات أربع ساعات في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. خلال فترة الحضانة التي تستغرق أربع ساعات، أعد حل 2X من مسبارات أنواع الأكسجين التفاعلية. لكل 10 ملليلتر من DMEM المصل المنخفضة اللازمة، إضافة أربعة ميكرولترات من كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي وأربعة ميكرولترات من كاشف كشف أكسيد فائق.
ثم، إعداد حلول مسبار 2X التي تحتوي فقط على كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي أو تحتوي على كاشف الكشف عن أكسيد فائق فقط. بعد فترة الحضانة التي تستغرق أربع ساعات، حصد الخلايا عن طريق كشط الأطباق بلطف، وجمعها في أنابيب ذات قيعان مستديرة ذات خمسة ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 750 مرات ز لمدة خمس دقائق.
تأكد من تتبع الخلايا التي تم التعامل معها مع مورين المضادة لـ BSA IgG1. بعد ذلك، قم بغسل كريات الخلايا بمليلترين من PBS للتخلص من أي بقايا مضادة لـ BSA من الخلايا المعالجة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 750 مرات ز لمدة خمس دقائق.
ثم، التعرق برنامج تلفزيوني وإعادة بناء بيليه الخلية في 600 ميكرولترات من DMEM المصل المنخفض. من تعليق الخلية 600 ميكرولتر، aliquot 200 ميكرولترات في أنابيب خمسة ملليلتر المستديرة القاعية. من الخلايا غير المعالجة، واتخاذ 200 ميكرولترات للأنابيب المسمى unstimulated، 200 ميكرولترر للأنابيب المسمى محفز إيجابي، و 200 ميكرولتررس للأنابيب المسمى تحريض إيجابي بالإضافة إلى مثبطات.
ثم, من الخلايا المعالجة المضادة BSA IgG1, اتخاذ 200 ميكرولترات لأنابيب المسمى FC-غاما مستقبلات الربط عبر, و 200 ميكرولترات للأنابيب المسمى FC-غاما مستقبلات عبر الربط بالإضافة إلى مثبطات. من الخلايا غير المعالجة لاستخدامها في ضوابط التعويض، واتخاذ 200 ميكرولترات للأنبوب المسمى غير الملطخة غير المُحفزة، و200 ميكرولترر للتحكم في محفز زائد أخضر، و200 ميكرولترر لمراقبة محفز البرتقال زائد. إعداد 2X محلول تحريض إيجابي عن طريق تمييع pyocyanin واحد إلى 100 في كل من حلول مسبار 2X لتركيز 500 ميكرومولار.
ثم، إعداد حل BSA 2X عن طريق تخفيف حل الأسهم BSA في حل مسبار 2X للحصول على تركيز 2X من اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر. قبل البدء في التحفيز المحدد، مثل FC-gamma مستقبلات الربط المتبادل، تأكد من أن جميع الكواشف والخلايا جاهزة ووضع الأنابيب على الجليد في الترتيب الذي سيتم تحفيزها. بالنسبة لمقياسات التدفق التي اصطُنِق بها جهاز ampler، لاحظ الوقت الذي يستغرقه مقياس السيتا لتحليل عينة واحدة والانتقال إلى العينة التالية.
تأكد من تضمين أي خلط وجسم غسل الخطوات. التوقيت أمر بالغ الأهمية لهذه الأقوال. من أجل كل حالة يمكن التحكم فيها بشكل جيد ، يجب إجراء التحفيز في 30 دقيقة بالضبط لكل حالة.
تحفيز الخلايا في النظام ودمج الوقت الفاصل بين الاكتساب العينة بواسطة مقياس التدفق. إذا كان أداء التعويض اليدوي في هذه المرحلة، وتحفيز أنابيب التحكم لاستخدامها في التعويض عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من حل مسبار 2X التي تحتوي على كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي والمحفز في أنابيب ملحوظ الأخضر زائد محفز. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من 2X حل مسبار يحتوي على كاشف الكشف عن أكسيد فائق والمحفز في أنابيب ملحوظ البرتقالي زائد مستحث.
احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام. باستخدام تدفق البرمجيات cytometry ، وتوليد وتسمية ثلاثة ملفات عينة للسيطرة ، غير المطّهية ، غير المعالجة ، والمحفز زائد الخضراء ، وعينات محفز البرتقال ، مع التأكد من الإشارة إلى القنوات والمعلمات التي سيتم تحليلها. أيضا، أدخل شروط التوقف المطلوبة.
وبمجرد إعداد عينات التحكم، قم بإنشاء مجموعة مماثلة من الملفات للعينات التجريبية وتسميتها. الآن، تشغيل العينة غير الملطخة وغير المعالجة. فتح مؤامرة نقطة للأمام مبعثر على محور س مقابل الجانب مبعثر على المحور ص ورسم بوابة حول الخلايا ذات الأهمية، باستثناء الخلايا الميتة والحطام.
بعد ذلك، استخدم بوابة هذه الخلية لفتح نقطة أخرى من علامة الفلورس الأول، FL1، على المحور س، مقابل علامة الفلورس الثانية، FL2، على المحور ص. رسم بوابة رباعية أولية ثم قم بضبط بوابة الربع بحيث تظهر الأحداث على الربع الأيسر السفلي من مؤامرة FL1 مقابل FL2. عند الانتهاء، تشغيل العينة الخضراء زائد مستحث.
ضبط الجهد بحيث تظهر الأحداث على الربعين السفليين الأيسر والأيني من FL1 مقابل FL2 مؤامرة. ثم، تطبيق هذه المصفوفة التعويض إلى كافة ملفات نموذج الثلاثة. الآن، تشغيل عينة محفز برتقال زائد.
ضبط الجهد بحيث تظهر الأحداث على الربعين العلوي والأيسر السفلي من FL1 مقابل FL2 مؤامرة، ثم تطبيق هذه المصفوفة التعويض على جميع ملفات عينة ثلاثة. تحقق من كل ملف التعويض والتأكد من أن الأحداث غير المطهية، غير المعالجة تظهر على الربع الأيسر السفلي، والأحداث الخضراء زائد تحريض تظهر على الربعين السفلي الأيمن والأيسر، والأحداث زائد البرتقال تظهر على الربعين العلوي والأيسر السفلي من FL1 مقابل FL2 مؤامرة. ثم، تطبيق مصفوفة التعويض على كافة ملفات عينة التجريبية.
وبمجرد أن يتم تنفيذ التعويض اليدوي وجرى الحصول على نموذج تجريبي، انتقل إلى العينات التجريبية. قبل علاج الخلايا بمحفز إيجابي أو إجراء تحفيز خلايا مستقبلات FC-Gamma ، ضع علامة على الأنابيب التي ستحصل على مثبط ROS. علاج هذه الخلايا مع مثبطات ROS على الأقل 30 دقيقة قبل المحفز الإيجابي أو FC-غاما تحفيز مستقبلات عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من المانع إلى 200 ميكرولتر من الخلايا resuspended لتركيز النهائي من خمسة ملليمولار.
للخلايا غير المُحَذَّة، عالج الخلايا بـ 200 ميكرولترات من محلول مسبار 2X دون أي حافز يضاف إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلايا المسمى الملون، غير المُحفز. للضوابط الإيجابية، علاج الخلايا مع 200 ميكرولترات من 2X محلول تحريض إيجابي إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى محفز إيجابي أو محفز إيجابي زائد المانع. وأخيرا، بالنسبة للخلايا التي تحفزها FC-غاما مستقبلات الربط عبر، علاج لهم مع 200 ميكرولترات من حل 2X BSA إضافة إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى FC-غاما مستقبلات crosslinking أو FC-غاما مستقبلات عبر الربط بالإضافة إلى مثبطات.
احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة، وتحليل العينات في الترتيب الذي تم تحفيزها، وذلك باستخدام تدفق cytometer وقوالب التحليل التي تم إنشاؤها خلال خطوات التعويض الأولية. وتبين البيانات المعروضة هنا أن عملية الكشف عن تدفق الخلايا من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن تحفيز الضامة من خلال مستقبلات FC-gamma.
هناك زيادة ملحوظة في FL1 وFL2 fluorescence عندما يتم تحفيز الخلايا مع عامل FC-غاما مستقبلات crosslinking. عندما تم علاج الخلايا مع مثبطات أنواع الأكسجين التفاعلية قبل FC-gamma مستقبلات الربط المتبادل، يتم جلب هذا الفلورس زيادة مرة أخرى إلى مستويات القاعدية. وعلى النقيض من ذلك، فإن هذه المؤامرات النقطية تقدم تجربة غير ناجحة، حيث لوحظ إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي دون المستوى الأمثل نتيجة لتحفيز مستقبلات FC-gamma.
لتسليط الضوء على الاختلافات الكبيرة بين النسب المئوية المتوقعة، أو زيادات MFI، تظهر هذه البيانات ما تبدو عليه العينات مع زيادة طفيفة في فلوريت FL1 وFL2. يستخدم البروتوكول الحالي خطوة فتيلة على مدار 24 ساعة. عند مقارنة 24 ساعة مقابل وقت فتيلة 48 ساعة، لم يكن هناك فرق ملحوظ في النسبة المئوية للخلايا إيجابية لمجهاد الأكسدة الخضراء.
ومع ذلك، فإن زيادة الوقت المؤقت إلى 48 ساعة لم تزيد النسبة المئوية للخلايا إيجابية لفلوريسنس البرتقال. أهم الأشياء التي يجب تذكرها عند تنفيذ هذا الإجراء هي التخطيط للمستقبل ، والاتساق حول توقيت الفحص للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ.
