반응성 산소 종 또는 ROS의 측정은 악명 높게 문제가 있습니다. 이 비디오에서는 형광 프로브및 유동 세포측정을 사용하여 FC 감마 수용체 교차에 대응하여 ROS의 재현 가능한 측정을 시연할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 분석의 재현성 및 특정 항원 자극을 갖는 이 방법의 사용, 미토겐 또는 알려진 ROS 유도제뿐만 아니라 이다.
Dysregulated ROS 생산은 만성 과종 종경 질환 또는 CGD와 같은 많은 질병의 발달의 중심입니다. ROS를 정확하게 측정하는 것은 CGD의 분자 진단의 한 부분을 구성할 수 있습니다. FC 매개 ROS 생산을 공부하는 것은 CGD와 같은 면역 결핍을 연구하는 데 중요하지만, 너무 많은 ROS가 산화 스트레스와 염증으로 이어지는 자가 면역 질환 또는 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데도 중요합니다.
분석의 타이밍은 매우 중요합니다. 나는 철저하게 준비하고 가능하면 모의 실험을 하기 위해 처음으로이 프로토콜을 시도하는 사람을 조언 할 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 분석의 타이밍과 같은 특별한 주의가 필요한 분석의 단계를 강조하기 위해 중요합니다.
먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조건부 미디어를 사용하여 골수 유래 대식세포를 준비합니다. 하룻밤 동안 대식세포를 프라이밍 한 후, 슈퍼 나티를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 씻으세요. 세럼은 미디어를 저혈DMEM의 동일한 부피로 대체하여 세포를 굶어 살린다.
각 마우스에 대해, 한 접시는 안티 BSA IgG1로 처리되며 다른 플레이트는 혈청이 굶주리고 다른 플레이트는 치료되지 않고 방치됩니다. 처리되지 않은 플레이트에 낮은 혈청 DMEM만 추가하고 처리된 플레이트에 뮤린 안티-BSA IgG1의 밀리리터 당 2.5 마이크로그램을 함유한 저혈무DMEM을 추가합니다. 유동 세포 보정 제어 역할을 각 실험에 대해 처리되지 않은 플레이트 1개를 추가로 포함해야 합니다.
플레이트를 섭씨 37도, CO2 5%로 4시간 배양합니다. 4시간 배양 시 반응성 산소 종 프로브의 2X 용액을 준비한다. 필요한 저혈구 DMEM의 10밀리리터당 산화 응력 검출 시약 4개미세리터와 초옥화물 검출 시약 4개소를 추가합니다.
이어서, 산화응력 검출 시약만을 포함하거나 초옥화물 검출 시약만 함유하는 2X 프로브 솔루션을 준비한다. 4 시간 배양 후, 부드럽게 접시를 긁어 하여 세포를 수확, 라벨, 다섯 밀리리터 둥근 바닥 튜브에서 수집. 5 분 동안 750 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
어떤 세포가 뮤린 항-BSA IgG1로 치료되었는지 추적하십시오. 다음으로, 처리된 세포로부터 잔류 항BSA를 제거하기 위해 PBS의 2밀리리터로 세포 펠릿을 씻는다. 5 분 동안 750 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
그런 다음 PBS를 흡인하고 저혈DMEM의 600 마이크로리터에서 세포 펠릿을 재중단합니다. 600 마이크로리터 셀 서스펜션에서 미리 표지된 5밀리리터 라운드 하단 튜브에 알리쿼트 200 마이크로리터. 처리되지 않은 세포에서, 자극되지 않은 표지된 튜브에 대해 200 마이크로리터, 양성 유도제라고 표시된 튜브용 마이크로리터 200개, 양성 유도제 플러스 억제제로 표시된 튜브용 마이크로리터 200개를 섭취하십시오.
그런 다음, 항 BSA IgG1 처리 된 세포에서, FC 감마 수용체 교차 링크라고 표시된 튜브에 대해 200 마이크로 리터를 복용하고 FC 감마 수용체 교차 링크 플러스 억제제에 대한 200 마이크로 리터를 복용하십시오. 보상 조절에 사용되는 처리되지 않은 세포에서, 200 마이크로리터를 복용하지 않은 자극되지 않은 튜브, 녹색 플러스 유도제용 마이크로리터 200개, 오렌지 플러스 유도제용 마이크로리터 200개. 피오시닌을 각각 2X 프로브 용액에 1~100을 희석시켜 500 마이크로몰러의 농도로 2배 양성 유도제 용액을 준비한다.
그런 다음 2X 프로브 솔루션에서 BSA 스톡 솔루션을 희석하여 밀리리터당 2마이크로그램의 2배 농도를 확보하여 2X BSA 솔루션을 준비한다. FC 감마 수용체 교차 연결과 같은 특정 자극을 시작하기 전에 모든 시약과 세포가 준비되어 있는지 확인하고 튜브를 얼음 위에 배치하여 자극될 순서대로 놓습니다. 자동 샘플러가 있는 유동 사이토미터의 경우 사이토미터가 하나의 샘플을 분석하고 다음 샘플로 이동하는 데 걸리는 시간을 기록합니다.
혼합 및 프로브 세척 단계를 포함해야 합니다. 타이밍은이 분석에 매우 중요합니다. 모든 조건이 잘 제어되기 위해서는 각 조건에 대해 정확히 30 분 안에 자극을 수행해야합니다.
순서대로 세포를 자극하고 흐름 세포계에 의한 샘플 수집 사이의 지연 시간을 통합합니다. 이 시점에서 수동 보정을 수행하는 경우, 산화 응력 검출 시약과 유도제를 포함하는 2X 프로브 솔루션의 200 마이크로리터를 녹색 플러스 유도제로 추가하여 보상에 사용되는 제어관을 자극한다. 이어서, 초옥화물 검출 시약과 유도제를 포함하는 2X 프로브 용액의 200마이크로리터를 주황색 플러스 유도제로 표시한 튜브에 첨가한다.
어둠 속에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 유동 세포측정 소프트웨어를 사용하여, 제어, 스테인드, 처리되지 않은, 녹색 플러스 유도자 및 주황색 플러스 유도자 샘플을 위한 세 개의 샘플 파일을 생성 및 라벨을 지정하여 분석할 채널및 매개변수를 표시합니다. 또한 원하는 정지 조건을 입력합니다.
제어 샘플이 설정되면 실험 샘플에 대해 유사한 파일 집합을 생성하고 레이블을 지정합니다. 이제 염색되지 않은 처리되지 않은 샘플을 실행합니다. Y축의 X축 과 측면 산란에 대한 전방 분산을 위한 점 플롯을 열고 죽은 세포와 파편을 제외한 관심 있는 셀 주위의 게이트를 그립니다.
다음으로, 이 세포의 게이트를 사용하여 X축에서 제1 형광 마커 FL1의 또 다른 점 플롯을 열고, Y축에서 제2 형광 마커 인 FL2를 엽니다. 초기 사분면 게이트를 그린 다음 사분면 게이트를 조정하여 이벤트가 FL1 대 FL2 플롯의 왼쪽 아래 사분면에 표시되도록 합니다. 완료되면 그린 플러스 유도제 샘플을 실행합니다.
이벤트가 FL1대 FL2 플롯의 왼쪽 아래 및 오른쪽 사분면에 표시되도록 전압을 조정합니다. 그런 다음 이 보정 매트릭스를 세 가지 샘플 파일 모두에 적용합니다. 지금, 오렌지 플러스 유도샘플을 실행합니다.
이벤트가 FL1 대 FL2 플롯의 왼쪽 위 및 아래 사분면에 표시되도록 전압을 조정한 다음 이 보정 행렬을 세 가지 샘플 파일 모두에 적용합니다. 각 보정 파일을 확인하고 왼쪽 아래 사분면에 스테인처리되지 않은 처리되지 않은 이벤트가 나타나고, 녹색 플러스 유도 이벤트가 왼쪽 아래와 오른쪽 사분면에 나타나고, 주황색 플러스 유도이벤트는 FL1 대 FL2 플롯의 왼쪽 위 및 하부 사분면에 나타납니다. 그런 다음 모든 실험 샘플 파일에 보상 행렬을 적용합니다.
수동 보정이 수행되고 실험 템플릿이 얻어지면 실험 샘플로 이동합니다. 양성 유도체로 세포를 치료하거나 FC 감마 수용체 세포 자극을 수행하기 전에 어떤 튜브가 ROS 억제제를 얻을 수 있는지 표시하십시오. 이들 세포를 5밀리알러의 최종 농도를 위해 200마이크로리터의 재중단 된 세포에 억제제의 1 마이크로리터를 첨가하여 양성 유도자 또는 FC 감마 수용체 자극 전에 적어도 30 분 전에 ROS 억제제로 이러한 세포를 치료한다.
자극되지 않은 세포의 경우, 2X 프로브 용액의 200 마이크로리터로 세포를 염색하고 자극하지 않은 세포 현탁액200 마이크로리터에 첨가하지 않고 치료한다. 양성 조절의 경우, 2X 양성 유도제 용액의 200 마이크로리터로 세포를 양성 유도제 또는 양성 유도제 플러스 억제제로 200마이크로리터로 치료한다. 마지막으로, FC 감마 수용체 교차링크에 의해 자극되는 세포의 경우, 2X BSA 용액의 200 마이크로리터로 치료하여 FC-감마 수용체 교차링크 또는 FC 감마 수용체 교차링크 또는 FC 감마 수용체 교차링크 플러스 억제제의 200 마이크로리터에 첨가하였다.
어둠 속에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 배양 후, 초기 보상 단계에서 생성된 유량 세포계 및 분석 템플릿을 사용하여 자극된 순서로 샘플을 분석한다. 여기에 표시된 데이터는 FC 감마 수용체를 통해 대식세포의 자극으로 인한 반응성 산소 종 생산의 유동 세포 측정 검출을 보여줍니다.
세포가 FC 감마 수용체 교차 연결제로 자극될 때 FL1 및 FL2 형광에 현저한 증가가 있습니다. 세포가 FC 감마 수용체 교차 링크 전에 반응성 산소 종 억제제로 치료되었을 때, 이 증가된 형광은 기저 수준으로 다시 가져온다. 대조적으로, 이러한 점 플롯은 FC 감마 수용체 자극의 결과로 최적이 아닌 반응성 산소 종 생산이 관찰된 실패한 실험을 제시한다.
예상 백분율 또는 MFI 증가 사이의 큰 차이점을 강조하기 위해 이 데이터는 FL1과 FL2 형광이 최소화된 샘플을 보여줍니다. 현재 프로토콜은 24시간 프라이밍 단계를 활용합니다. 24시간 대 48시간 프라이밍 시간을 비교했을 때, 녹색 산화 스트레스 시약에 대해 양성 세포의 비율에는 현저한 차이가 없었습니다.
그러나 프라이밍 시간을 48시간으로 늘리면 주황색 형광에 대해 양성 세포의 백분율을 증가시키는 것이 나타났다. 이 절차를 수행 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 미리 계획하고, 재현 가능한 결과를 얻기 위해 분석의 타이밍에 대해 일관성이되는 것입니다.
