A medição de espécies reativas de oxigênio ou ROS é notoriamente problemática. Neste vídeo, demonstraremos a medição reprodutível do ROS em resposta ao crosslinking do receptor FC-gama usando sondas fluorescentes e citometria de fluxo. As principais vantagens desta técnica são a reprodutibilidade do ensaio e o uso deste método com estímulos antigênicos específicos, não apenas mitogênios ou indutores ros conhecidos.
A produção de ROS desregulada é central para o desenvolvimento de muitas doenças, como doenças granulomatosas crônicas ou CGD. Medir com precisão a ROS pode constituir uma parte do diagnóstico molecular de CGD. Estudar a produção de ROS mediada por FC é importante no estudo de imunodeficiências, como a CGD, mas também no estudo de doenças autoimunes, ou doenças neurodegenerativas, onde muito ROS leva ao estresse oxidativo e inflamação.
O tempo do ensaio é crítico. Eu aconselharia alguém a tentar este protocolo pela primeira vez para se preparar completamente e fazer um experimento simulado, se possível. A demonstração visual deste método é fundamental para enfatizar as etapas do ensaio que precisam de atenção especial, como o tempo do ensaio.
Para começar, prepare os macrófagos derivados da medula óssea usando meios de comunicação condicionados, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Depois de preparar os macrófagos durante a noite, aspire o supernasce e lave as células uma vez com PBS. O soro esflou as células substituindo a mídia pelo mesmo volume de DMEM de baixo soro.
Para cada rato, uma placa será tratada com anti-BSA IgG1 enquanto o soro passa fome enquanto o outro não será tratado. Adicione apenas DMEM de baixo soro às placas não tratadas e adicione DMEM de baixo soro contendo 2,5 microgramas por mililitro de murine anti-BSA IgG1 às placas tratadas. Certifique-se de incluir uma placa não tratada adicional para cada experimento para agir como o controle de compensação citométrica de fluxo.
Incubar as placas quatro horas a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Durante a incubação de quatro horas, prepare uma solução 2X das sondas reativas da espécie de oxigênio. Para cada 10 mililitros de DMEM de baixo soro necessários, adicione quatro microliters de um reagente oxidativo de detecção de estresse e quatro microliters de um reagente de detecção de superóxido.
Em seguida, prepare as soluções da sonda 2X contendo apenas o reagente oxidativo de detecção de estresse ou contendo apenas o reagente de detecção de superóxido. Após a incubação de quatro horas, colde as células raspando suavemente as placas, coletando-as em tubos de fundo redondo de cinco mililitros. Centrifugar os tubos a 750 vezes g durante cinco minutos.
Certifique-se de acompanhar quais células foram tratadas com murine anti-BSA IgG1. Em seguida, lave as pelotas celulares com dois mililitros de PBS para se livrar de qualquer anti-BSA residual das células tratadas. Centrifugar os tubos a 750 vezes g durante cinco minutos.
Em seguida, aspire o PBS e resuspenja a pelota celular em 600 microliters de DMEM de baixo soro. A partir da suspensão celular de 600 microliteres, alíquota de 200 microliters nos tubos de fundo redondo pré-rotulados de cinco mililitros. Das células não tratadas, pegue 200 microliters para os tubos rotulados sem estimulação, 200 microliters para os tubos rotulados como indutores positivos, e 200 microliters para os tubos rotulados como indutor positivo mais inibidor.
Em seguida, das células tratadas anti-BSA IgG1, pegue 200 microliters para tubos rotulados de crosslinking do receptor FC-gama, e 200 microliters para tubos rotulados fc-gama receptor crosslinking mais inibidor. Das células não tratadas a serem usadas para controles de compensação, pegue 200 microliters para o tubo rotulado sem manutenção não identificado, 200 microliters para o controle verde mais indutor, e 200 microlitres para o controle laranja mais indutor. Prepare uma solução de indutor positivo 2X diluindo a pyocyanina de 1 a 100 em cada uma das soluções de sonda 2X para uma concentração de 500 micromolar.
Em seguida, prepare uma solução 2X BSA diluindo a solução de estoque BSA na solução de sonda 2X para obter uma concentração 2X de dois microgramas por mililitro. Antes de iniciar a estimulação específica, como o crosslinking do receptor FC-gama, certifique-se de que todos os reagentes e células estejam prontos e coloque os tubos no gelo na ordem em que serão estimulados. Para citómetros de fluxo com um autosampler, anote o tempo que o cítmetro leva para analisar uma amostra e passar para a próxima.
Certifique-se de incluir quaisquer etapas de mistura e lavagem de sondas. O tempo é muito crítico para este ensaio. Para que cada condição seja bem controlada, a estimulação precisa ser realizada em exatamente 30 minutos para cada condição.
Estimule as células em ordem e incorpore o tempo de defasagem entre as aquisições amostrais pelo citômetro de fluxo. Se realizar compensação manual neste momento, estimule os tubos de controle a serem usados para compensação adicionando 200 microliters da solução da sonda 2X contendo o reagente oxidativo de detecção de estresse e o indutor nos tubos marcados verde mais indutor. Em seguida, adicione 200 microliters de solução de sonda 2X contendo o reagente de detecção de superóxido e o indutor nos tubos marcados laranja mais indutor.
Incubar as células por 30 minutos no escuro. Utilizando o software de citometria de fluxo, gerar e rotular três arquivos de amostra para o controle, não identificado, não tratado, o indutor verde mais, e as amostras de indutor laranja plus, certificando-se de indicar os canais e parâmetros a serem analisados. Além disso, entre nas condições de parada desejadas.
Uma vez configurados as amostras de controle, gere e rotule um conjunto semelhante de arquivos para as amostras experimentais. Agora, execute a amostra não tratada e não tratada. Abra um gráfico de pontos para dispersão para a frente no eixo X versus dispersão lateral no eixo Y e desenhe um portão ao redor das células de interesse, excluindo células mortas e detritos.
Em seguida, use o portão desta célula para abrir outro gráfico de pontos do primeiro marcador de fluorescência, FL1, no eixo X, contra o segundo marcador de fluorescência, FL2, no eixo Y. Desenhe um portão do quadrante inicial e ajuste o portão do quadrante para que os eventos apareçam no quadrante inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2. Quando terminar, execute a amostra verde mais indutor.
Ajuste a tensão para que os eventos apareçam nos quadrantes inferior esquerdo e direito da trama FL1 versus FL2. Em seguida, aplique esta matriz de compensação em todos os três arquivos de amostra. Agora, execute a amostra laranja mais indutor.
Ajuste a tensão para que os eventos apareçam nos quadrantes superior e inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2 e, em seguida, aplique esta matriz de compensação em todos os três arquivos de amostra. Verifique cada arquivo de compensação e certifique-se de que eventos não tratados e não tratados apareçam no quadrante inferior esquerdo, os eventos de indutor verde mais aparecem nos quadrantes inferior esquerdo e direito, e os eventos de laranja mais indutor aparecem nos quadrantes superior e inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2. Em seguida, aplique a matriz de compensação a todos os arquivos de amostra experimental.
Uma vez realizada a compensação manual e um modelo experimental, passe para as amostras experimentais. Antes de tratar as células com um indutor positivo ou realizar estimulação celular receptor FC-gama, marque quais tubos receberão um inibidor ros. Trate essas células com o inibidor ROS pelo menos 30 minutos antes do indutor positivo ou estimulação do receptor FC-gama adicionando um microlitr do inibidor a 200 microliters de células resuspended para uma concentração final de cinco milimiliar.
Para células não estimuladas, trate as células com 200 microliters da solução de sonda 2X sem qualquer estímulo adicionado aos 200 microliters de suspensão celular rotulados manchados, não estimulados. Para controles positivos, trate as células com 200 microlitres da solução indutora positiva 2X para 200 microlitres de suspensão celular rotulados como indutor positivo ou inibidor positivo mais inibidor. Finalmente, para células estimuladas pelo crosslinking do receptor FC-gama, trate-as com 200 microliters da solução 2X BSA adicionadas a 200 microliters da suspensão celular rotulada fc-gama receptor crosslinking ou receptor FC-gama crosslinking plus inibidor.
Incubar as células por 30 minutos no escuro. Após a incubação, analise as amostras na ordem em que foram estimuladas, utilizando o citômetro de fluxo e os modelos de análise gerados durante as etapas iniciais de compensação. Os dados aqui mostrados demonstram a detecção citométrica de fluxo da produção de espécies reativas de oxigênio resultante da estimulação de macrófagos através do receptor FC-gama.
Há um aumento acentuado na fluorescência FL1 e FL2 quando as células são estimuladas com o agente de crosslinking do receptor FC-gama. Quando as células foram tratadas com o inibidor reativo da espécie oxigênio antes do crosslinking do receptor FC-gama, esse aumento da fluorescência é trazido de volta aos níveis basais. Em contraste, essas parcelas de pontos apresentam um experimento mal sucedido, onde foi observada a produção de espécies de oxigênio reativa subótimo como resultado da estimulação do receptor FC-gama.
Para destacar as grandes diferenças entre os percentuais esperados, ou aumentos de IMFI, esses dados mostram como são as amostras com um aumento mínimo da fluorescência FL1 e FL2. O protocolo atual utiliza uma etapa de escoramento de 24 horas. Ao comparar um tempo de 24 horas versus 48 horas de escoramento, não houve diferença acentuada na porcentagem de células positivas para o reagente de estresse oxidativo verde.
No entanto, o aumento do tempo de escoramento para 48 horas aumentou a porcentagem de células positivas para a fluorescência laranja. As coisas mais importantes a serem lembradas ao realizar este procedimento é planejar com antecedência, e ser consistente sobre o tempo do ensaio para obter resultados reprodutíveis.
