活性酸素種またはROSの測定は、悪名高い問題です。本ビデオでは、蛍光プローブとフローサイトメトリーを用いたFC-γ受容体架橋に対するROSの再現性測定について説明します。この技術の主な利点は、測定の再現性と、特定の抗原刺激を用いたこの方法の使用であり、マイトゲンまたは既知のROS誘導体だけではない。
不秩序なROSの生産は、慢性肉芽腫症やCGDなどの多くの疾患の発症の中心である。ROSを正確に測定すると、CGDの分子診断の一部を構成する可能性があります。FC媒介ROS産生の研究は、CGDなどの免疫不全を研究する上で重要であるが、ROSが多すぎると酸化ストレスや炎症を引き起こす自己免疫疾患や神経変性疾患の研究においても重要である。
アッセイのタイミングは非常に重要です。私は、このプロトコルを初めて試してみて、徹底的に準備し、可能であれば模擬実験を行うことを勧める。この方法の視覚的な実証は、アッセイのタイミングなど特に注意を必要とするアッセイのステップを強調するために重要である。
まず、付属のテキストプロトコルに記載されているように、条件付きメディアを使用して骨髄由来マクロファージを調製する。マクロファージを一晩プライミングした後、上清を吸引し、PBSで細胞を一度洗う。血清は、低血清DMEMの同じ体積で培地を交換することにより、細胞を飢えさせる。
各マウスについて、1つのプレートは抗BSA IgG1で処理され、もう一方は残して、もう一方は飢餓状態になります。未処理のプレートにのみ低血清DMEMを加え、処理されたプレートにマウス抗BSA IgG1の1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを含む低血清DMEMを加えます。各実験がフローサイトメトリック補償制御として機能する場合は、1 つの追加の未処理プレートを含めます。
プレートを摂氏37度、5%CO2で4時間インキュベートします。4時間のインキュベーション中に、活性酸素種プローブの2倍溶液を調製する。必要な低血清DMEMの10ミリリットルごとに、酸化ストレス検出試薬4マイクロリットルとスーパーオキシド検出試薬4マイクロリットルを追加します。
次いで、酸化ストレス検出試薬のみを含む、またはスーパーオキシド検出試薬のみを含有する2Xプローブ溶液を調製する。4時間のインキュベーションの後、プレートをそっと削り取って細胞を収穫し、ラベル付けされた5ミリリットルの丸底チューブに集めます。チューブを750回gで5分間遠心分離する。
マウス抗BSA IgG1で処理された細胞を必ず追跡してください。次に、細胞ペレットを2ミリリットルのPBSで洗浄し、処理した細胞から残った抗BSAを取り除きます。チューブを750回gで5分間遠心分離する。
次いで、PBSを吸引し、低血清DMEMの600マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。600マイクロリットルの細胞懸濁液から、アリコート200マイクロリットルは、あらかじめラベル付けされた5ミリリットルのラウンドボトムチューブに入った。未処理の細胞から、無刺激で標識されたチューブに対して200マイクロリットル、陽性誘導体と標識されたチューブに対して200マイクロリットル、プラスインデューサープラスインヒビターと標識されたチューブに対して200マイクロリットルを取る。
次いで、抗BSA IgG1処理細胞から、FC-γ受容体架橋と標識されたチューブに対して200マイクロリットル、FC-γ受容体架橋プラス阻害剤と標識したチューブに対して200マイクロリットルを取る。補償制御に使用する未処理の細胞から、無刺激で染色されたチューブに対して200マイクロリットル、緑色プラスインデューサーコントロール用に200マイクロリットル、オレンジプラスインデューサーコントロールに200マイクロリットルを取ります。ピオシアニンを1~100の各2Xプローブ溶液に500マイクロモルの濃度に希釈して2X陽性誘導剤溶液を調製する。
次いで、2Xプローブ溶液中のBSAストック溶液を希釈して2X BSA溶液を調製し、1ミリリットル当たり2マイクログラムの2倍濃度を得た。FC-γ受容体架橋などの特異的刺激を開始する前に、試薬と細胞の準備ができていることを確認し、刺激される順序でチューブを氷の上に置きます。オートサンプラーを使用したフローサイトメーターの場合、サイトメーターがサンプルを分析して次のサンプルに進むためにかかる時間をメモします。
混合とプローブ洗浄のステップを必ず含めます。このアッセイにとってタイミングは非常に重要です。すべての状態を十分に制御するためには、各条件に対して正確に30分で刺激を行う必要があります。
順番に細胞を刺激し、フローサイトメーターによるサンプル取得間のラグタイムを組み込みます。この時点で手動補償を行う場合、酸化ストレス検出試薬とインデューサを含む200マイクロリットルの200マイクロリットルを緑色プラスインデューサーとマークされたチューブに加えて補償に使用する制御チューブを刺激する。次に、スーパーオキシド検出試薬とインデューサを含む200マイクロリットルの2Xプローブ溶液をオレンジプラスインデューサーとマークされたチューブに加える。
暗闇の中で30分間細胞をインキュベートします。フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、制御用の3つのサンプルファイルを生成し、未処理、緑色プラスインデューサー、およびオレンジプラスインデューサーサンプルを生成し、分析するチャネルとパラメータを示すことを確認します。また、目的の停止条件を入力します。
コントロールサンプルを設定したら、実験サンプル用の同様のファイルセットを生成し、ラベルを付けます。次に、未染色の未処理サンプルを実行します。X 軸上の前方散布と Y 軸上の側の散布のドット プロットを開き、死んだセルや破片を除く目的のセルの周囲にゲートを描画します。
次に、このセルのゲートを使用して、X軸上の第1の蛍光マーカーFL1の別のドットプロットを開き、第2の蛍光マーカーFL2をY軸に開きます。最初の象限ゲートを描画し、イベントが FL1 と FL2 プロットの左下の象限に表示されるように、象限ゲートを調整します。完了したら、緑色のプラス誘導サンプルを実行します。
FL1 プロットと FL2 プロットの左下および右象限にイベントが表示されるように、電圧を調整します。次に、この補正マトリックスを 3 つのサンプル ファイルすべてに適用します。オレンジ色のプラス誘導サンプルを実行します。
FL1 プロットと FL2 プロットの左下の領域にイベントが表示されるように電圧を調整し、この補正マトリックスを 3 つのサンプル ファイルすべてに適用します。各補正ファイルを確認し、左下象限に未染色の未処理イベントが表示され、緑と誘導子のイベントが左下および右象限に表示され、オレンジ色の加えた誘導子イベントが FL1 と FL2 プロットの左上および下方象限に表示されることを確認します。次に、すべての実験サンプルファイルに補償行列を適用する。
手動補正が実行され、実験テンプレートが取得されたら、実験サンプルに移ります。陽性誘導体で細胞を治療するか、FC-γ受容体細胞刺激を行う前に、どのチューブがROS阻害剤を得るかをマークする。陽性誘導体またはFC-γ受容体刺激の少なくとも30分前に、5ミリモルの最終濃度のために再懸濁細胞の200マイクロリットルに1マイクロリットルを加えることによって、ROS阻害剤でこれらの細胞を治療する。
非刺激細胞の場合、200マイクロリットルの細胞懸濁液に刺激を加えることなく2Xプローブ溶液で細胞を処理し、染色され、刺激を受けていないとラベル付けした細胞懸濁液を添加する。陽性コントロールの場合、2X陽性誘導体溶液の200マイクロリットルを陽性誘導体または陽性誘導因子プラス阻害剤と標識した細胞懸濁液の200マイクロリットルで細胞を治療する。最後に、FC-γ受容体架橋によって刺激された細胞については、FC-γ受容体架橋またはFC-γ受容体架橋プラス阻害剤と標識した細胞懸濁液の200マイクロリットルに200マイクロリットルの200マイクロリットルを添加してそれらを処理する。
暗闇の中で30分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、初期補償ステップ中に生成されたフローサイトメーターと分析テンプレートを使用して、刺激された順にサンプルを分析します。ここに示すデータは、FC-γ受容体を介したマクロファージの刺激に起因する活性酸素種産生のフローサイトメトリック検出を示す。
細胞がFC-γ受容体架橋剤で刺激されると、FL1およびFL2蛍光が顕著に増加する。細胞がFC-γ受容体架橋前に活性酸素種阻害剤で処理された場合、この増加した蛍光は基底レベルに戻される。対照的に、これらのドットプロットは、FC-γ受容体刺激の結果として最適以下の活性酸素種産生が観察された、失敗した実験を提示する。
期待されるパーセンテージの大きな違いを強調するために、またはMFIが増加する、このデータは、FL1およびFL2蛍光の最小の増加を伴うサンプルがどのようなものであるかを示す。現在のプロトコルは、24 時間のプライミング ステップを使用します。24時間対48時間のプライミング時間を比較した場合、緑色酸化ストレス試薬に対する細胞陽性の割合に顕著な差はなかった。
しかし、プライミング時間を48時間に増やすことは、オレンジ色の蛍光に対する陽性細胞の割合を増加させた。この手順を実行する際に覚えておくべき最も重要なことは、事前に計画し、再現可能な結果を得るためにアッセイのタイミングについて一貫することです。
