活性氧物种或ROS的测量是出了名的问题。在这段视频中，我们将演示ROS的可重复测量，以响应使用荧光探针和流式细胞学的FC-伽马受体交联。该技术的主要优点是测定的可重复性，以及使用这种方法与特定的抗原刺激，不仅米罗根或已知的ROS诱导剂。
失调的ROS生产是许多疾病，如慢性肉芽肿疾病或CGD的发展的核心。准确测量ROS可以构成CGD分子诊断的一部分。研究 FC 调媒体对研究免疫缺陷（如 CGD）非常重要，但也在研究自身免疫性疾病或神经退行性疾病（其中 ROS 太多导致氧化应激和炎症）方面也很重要。
测定的时机至关重要。我建议第一次尝试这个协议的人要做充分的准备， 如果可能的话， 做一个模拟实验。这种方法的视觉演示对于强调需要特别注意的测定步骤（如测定的时间）至关重要。
首先，使用附带的文本协议中描述的条件介质准备骨髓衍生的巨噬细胞。在一夜之间对巨噬细胞进行吸气后，吸上经，用PBS清洗细胞一次。血清用相同体积的低血清DMEM取代介质，使细胞挨饿。
对于每只小鼠，一个板将治疗抗BSAIgG1，而血清挨饿，而另一个将离开未经治疗。在未经处理的板材中只添加低血清DMEM，并将每毫升莫林抗BSA IgG1含有2.5微克的低血清DMEM添加到经过处理的板材中。确保每个实验都包括一个额外的未经处理的板，以作为流动细胞测量补偿控制。
在37摄氏度、5%CO2下孵育板4小时。在四个小时的孵育过程中，准备活性氧物种探针的2X溶液。对于每需要 10 毫升的低血清 DMEM，添加 4 微升氧化应激检测试剂和 4 微升超氧化物检测试剂。
然后，准备仅包含氧化应力检测试剂或仅含有超氧化物检测试剂的2X探针溶液。经过四个小时的孵育，通过轻轻刮过盘子，用五毫升的圆底管收集细胞。将管子以750倍g离心5分钟。
请务必跟踪哪些细胞被用穆林抗 BSA IgG1 治疗。接下来，用两毫升PBS清洗细胞颗粒，以去除治疗细胞中残留的抗BSA。将管子以750倍g离心5分钟。
然后，吸气PBS，在600微升低血清DMEM中重新暂停细胞颗粒。从600微升电池悬浮液，等方200微升进入预标记的5毫升圆底管。从未经处理的细胞中，为标有未发法的管子服用200微升，为标有正诱导剂的管子服用200微升，为标有正诱导剂加抑制剂的管子服用200微升。
然后，从抗BSAIgG1处理细胞，采取200微升的管标记FC-伽马受体交联，200微升管标记FC-伽马受体交联加抑制剂。从用于补偿控制的未经处理的细胞中，为标有未污染的管子服用200微升，为绿色加诱导剂控制服用200微升，为橙色加诱导剂控制服用200微升。通过将皮奥氰辛稀释到每个 2X 探针溶液中，以 500 微摩尔的浓度，准备 2 倍正诱导剂溶液。
然后，通过稀释 2X 探针溶液中的 BSA 库存溶液来准备 2X BSA 溶液，以获得每毫升 2 微克的 2X 浓度。在开始特定的刺激（如 FC-伽马受体交联）之前，确保所有试剂和细胞都准备就绪，并将管子放在冰上，按其刺激的顺序排列。对于带自动采样器的流动圆度计，请注意圆度计分析一个样本并转到下一个样本的时间。
请务必包括任何混合和探头清洗步骤。时间对于这个测定非常关键。为了很好地控制每个情况，每个条件需要在30分钟内进行刺激。
按顺序刺激细胞，并纳入流动细胞仪采集样本之间的滞后时间。如果此时执行手动补偿，则通过将含有氧化应力检测试剂和诱导剂的 2X 探针溶液中的 200 微升加入标有绿色外加诱导剂的管中来刺激控制管以进行补偿。然后，将含有超氧化物检测试剂和诱导剂的200微升2X探针溶液加入标有橙色加诱导剂的管中。
在黑暗中孵育细胞30分钟。使用流式细胞学软件，生成并标记三个样本文件，用于控制、未污染、未经处理、绿色加诱导剂和橙色加诱导剂样本，确保指示要分析的通道和参数。此外，输入所需的停止条件。
设置控制样本后，为实验样本生成并标记一组类似的文件。现在，运行未经污染的未经处理的样品。打开 X 轴上向前散射的点图，而在 Y 轴上打开侧散射点，并在感兴趣的细胞周围绘制一个栅极，不包括死细胞和碎片。
接下来，使用此单元的栅极打开 X 轴上第一个荧光标记 FL1 的另一个点图，而 Y 轴上的第二个荧光标记 FL2。绘制初始象限门，然后调整象限门，以便事件出现在 FL1 与 FL2 绘图的左下象限上。完成后，运行绿色加诱导剂样本。
调整电压，使事件出现在 FL1 与 FL2 图的左下、右象限上。然后，将此补偿矩阵应用于所有三个示例文件。现在，运行橙色加诱导剂样本。
调整电压，使事件出现在 FL1 与 FL2 图的左上和下四边形上，然后将此补偿矩阵应用于所有三个样本文件。检查每个补偿文件，并确保未污染的、未经处理的事件出现在左下象限上，绿色加诱导器事件出现在左下两个象限上，橙色加诱导器事件出现在 FL1 与 FL2 图的左下两个象限上。然后，将补偿矩阵应用于所有实验样本文件。
执行手动补偿并获取实验模板后，转到实验样本。在用正诱导剂或进行FC-伽马受体细胞刺激治疗细胞之前，标记哪些管子会得到ROS抑制剂。在正诱导剂或FC-伽马受体刺激前至少30分钟用ROS抑制剂治疗这些细胞，将抑制剂的一微升加入200微升的再增细胞，最终浓度为5毫摩尔。
对于未刺激的细胞，使用 2X 探针溶液的 200 微升处理细胞，而无需在标记有染色、未染色的 200 微升细胞悬浮液中添加任何刺激。对于正对照，用2X正诱导剂溶液的200微升治疗细胞，以200微升的细胞悬浮液标记为正诱导剂或正诱导剂加抑制剂。最后，对于受FC-伽马受体交联刺激的细胞，用2X BSA溶液的200微升进行治疗，加入200微升的细胞悬浮液，标有FC-伽马受体交联或FC-伽马受体交联加抑制剂。
在黑暗中孵育细胞30分钟。孵育后，使用流式细胞仪和初始补偿步骤中生成的分析模板，按照受刺激的顺序分析样品。此处显示的数据表明，通过FC-伽马受体刺激巨噬细胞，对活性氧物种的流式细胞测量检测。
当细胞受到FC-伽马受体交联剂的刺激时，FL1和FL2荧光显著增加。当细胞在FC-伽马受体交联之前用活性氧物种抑制剂进行治疗时，这种增加的荧光被带回基底水平。相比之下，这些点图提出了一个不成功的实验，其中观察到FC-伽马受体刺激导致的不理想的活性氧物种产生。
为了突出预期百分比或 MFI 增加之间的较大差异，此数据显示 FL1 和 FL2 荧光最小增加的样本如下所示。当前协议使用 24 小时启动步骤。在比较24小时与48小时启动时间时，绿色氧化应激试剂的细胞阳性百分比没有明显差异。
然而，将启动时间增加至48小时确实增加了橙色荧光的细胞阳性百分比。执行此过程时，要记住的最重要的事情是提前计划，并始终如一地确定检测的时间，以获得可重现的结果。
