إن تحسين التسليم الحراري، أو CED، للنواقل الفيروسية البصرية في الرئيسيات غير البشرية سيمكن الباحثين من التعامل مع النشاط العصبي على نطاق واسع لفهم الحسابات والسلوكيات العصبية المعقدة. مع CED يمكننا تحقيق التعبير البصري عالية عبر مناطق واسعة من الدماغ الرئيسيات مع حقن قليلة فقط في فترة قصيرة من الزمن مقارنة مع الطرق التقليدية. يتم إجراء الرنين المغناطيسي أو زرع غرفة MR متوافقة باستخدام الممارسة القياسية في العمليات الجراحية الرئيسيات غير البشرية ، يتم وصف الإجراء بالتفصيل في بروتوكول النص ويرد موجزًا بإيجاز في هذا الفيديو.
بعد التخوم الحيوانية، وتحديد المواقع، والشق الأولي كما هو موضح في بروتوكول النص، قم بإنشاء عملية استئصال القحف الدائرية لتغطية المسارات المخططة مسبقًا للحقن باستخدام التريبين. إنشاء المسافة البادئة في وسط استئصال القحف المخطط لها في عمق كاف في الجمجمة لترسيخ التريبين باستخدام نقطة مركز قابل للتعديل من التريبين. مرة واحدة تم إجراء المركز، خفض trephine على الجمجمة وتدوير التربتين في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة أثناء تطبيق الضغط النزولي حتى يمكن إزالة غطاء العظام مع ملقط.
بعد رفع دورا كما هو مفصل في بروتوكول النص، وقطع دورا من المركز إلى حافة استئصال القحف والاستمرار على طول الحافة مع مقص العيون غرامة. جبل العرف أسطواني جعل الحمل الحراري تعزيز تسليم MR غرفة متوافقة مع الجمجمة على رأس استئصال القحف لتوفير دعم القنب أثناء التسريب بحيث انحناء شفة الغرفة محاذاة بشكل جيد مع انحناء الجمجمة. تأمين يزرع إلى الجمجمة باستخدام إما مسامير بلاستيكية والأكريليك الأسنان أو مسامير التيتانيوم قليلة.
بعد وقت قصير من زرع غرفة متوافقة MR وإدراج شبكة حقن القنية في الغرفة، وملء الشبكة مع 0.9٪ المالحة لتصور مواقع الحقن عن طريق الصور التشريحية MR. أيضا ملء تجاويف الغرفة مع رغوة هلام معقم قابل للامتصاص الرطب للحفاظ على رطوبة الدماغ. تغطية الجلد والاسطوانة مع التنقية المضادة للميكروبات معقمة لتغطيه للحفاظ على عقم الاسطوانات أثناء النقل وFUES.
ضع كبسولة فيتامين E لوضع علامة على الجزء العلوي من شبكة الحقن لتحديد الهوية الإيجابية. بينما يبقى الحيوان في حالة انبات، فصل أنبوب endotracheal من دائرة التخدير وإعادة ربطه إلى جهاز ISOflurane MR المحمولة المتوافقة. نقل الحيوان إلى ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي.
الحصول على صور T1 لحساب المسافة من أعلى شبكة الحقن والسطح القشرية. الكبسولة فيتامين (ه) واضحة في الصور T1 وينبغي أن تستخدم كعلامة لأعلى شبكة الحقن. الحصول على صور T2 لتحديد أدلة cannula الأمثل لكل موقع على أساس الموقع المستهدف من التسريب.
تمتلئ شبكة القنية بالملحة المالحة التي هي أفضل مرئية في صور T2. باستخدام برنامج التصوير MR، انتقل من خلال الطائرات التاجية والقوس للعثور على الموقع المستهدف من التسريب. بعد ذوبان ناقلات الفيروسية لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة، وخلط ناقلات الفيروسية مع وكيل تباين MR gadoteridol عن طريق خلط ماصة أو دوامة.
تحميل الفيروس المختلط في 0.2 ملليلتر ارتفاع ضغط الرابع أنابيب. باستخدام ارتفاع ضغط أنابيب الرابع، وربط خط تمديد طويل إلى حقنة MR متوافقة ثلاث ملليلتر ورئيس مع المالحة. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنابيب التمديد الطويلة إلى أنابيب IV 0.2 ملليلتر محملة بالفيروس.
ثم نعلق على cannula مقاومة الجزر مع تلميح ملليلتر واحد صعدت إلى نهاية هذا التجميع مع موصل القسطرة نمط المشبك. وأخيرا تعيين حقنة في مضخة MR متوافق. باستخدام الصور MR تشريحية خط الأساس، حدد موقع شبكة حقن كانولا وعمق الإدراج اللازمة للوصول إلى موقع ضخ الهدف.
وضع علامة على عمق الإدراج على القنية باستخدام شريط معقمة. تبدأ ضخ بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة والتحقق بصريا من تدفق السائل في خط التسريب عن طريق مراقبة طرد السائل من تلميح كانولا. إدراج القنية يدويا من خلال شبكة الحقن إلى عمق الهدف مع الحفاظ على تدفق في خط التسريب لأن هذا سيمنع الأنسجة اختراق انسداد كانولا أثناء الإدراج.
الآن الحصول على فلاش سريع T1-المرجح الصور لرصد على الانترنت من ضخ ناقلات الفيروسية. بعد غرس ما يقرب من 10 ميكرولترات من الناقل بحيث يتم غرس ما يكفي من الفيروسات للكشف في الماسح الضوئي MR، والحصول على صور MR للتحقق من وضع كانولا الصحيح كما يتضح من انتشار لاحظت الفيروس. إذا كان عمق القنية المدرجة غير صحيح، ضبط العمق وفقا لذلك أو ببطء إزالة القنية وإعادة استخدام الإدراج.
مراقبة التسريب عن طريق توجيه الصور MR على الانترنت. زيادة معدل التسريب إلى خمسة ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة من قبل microliter واحد في خطوات دقيقة كل بضع دقائق. من المهم زيادة معدل التسريب ببطء وعدم تجاوز خمسة ميكرولترات في الدقيقة الواحدة حيث أن معدلات التسريب العالية يمكن أن تسبب تلف الأنسجة.
بعد ضخ ما يقرب من 40 ميكرولترات من ناقلات الفيروسية، والبدء في خفض معدل التسريب من قبل microliter واحد في خطوات دقيقة. وقف التسريب بعد حقن ما يقرب من 50 ميكرولترات. اتركي القنية في مكانها لمدة عشر دقائق.
إزالة ببطء كانولا من الدماغ والانتقال إلى الموقع التالي. غطي الأسطوانة بستارة معقمة في نهاية الحقن قبل نقل الحيوانات، ثم نقل الحيوان مرة أخرى إلى غرفة العمليات. تكشف التحليلات النسيجية على الأقسام التاجية التسلسلية عن تعبير optogenetic واسع النطاق حول مواقع التسريب.
يظهر هنا هو صورة MR الإكليلي الأساسي وانتشار عامل التباين بعد التسريب لنفس شريحة MR coronal. يظهر قسم الأنسجة التاجية من نفس القسم تقريبًا. يعكس تلطيخ البيروكسيديز التعبير عن البروتين الفلورسنت الأصفر أو مراسل EYFP.
ويلاحظ محاذاة جيدة بين منطقة التعبير EYFP، تقاس مع epifluorescense السطح ومع تلطيخ النسيج. وتشمل هذه المناطق انتشار ناقلات الناقلات المقدرة من صور MR. تشير النقاط البيضاء إلى مواقع الحقن وتمثل المنطقة السوداء بأكملها المنطقة التي يتعرض لها استئصال القحف.
يظهر هنا هو صورة التكبير منخفضة من المقاطع التاجية الملطخة بالأجسام المضادة GFP تظهر الجانب الجانبي الوسيط للتعبير YFP في القشرة somatosensory. يشير رأس السهم الأسود إلى موقع مسار القنيولا. يظهر النسيج المجاور في أكبر التكبير لإظهار توزيع laminar من الخلايا الإيجابية YFP.
وتقع المناطق الكثيفة السكان من الخلايا الإيجابية YFP في الغالب في الطبقات من 2 إلى 3 وخمسة إلى ستة. مزيد من التوسعة يكشف عن خلايا هرمية نموذجية في طبقات من اثنين إلى ثلاثة، وطبقة خمسة، وطبقة السادسة. من المهم ترك القنية في مكانها لمدة 10 دقائق بعد توقف التدفق.
وهذا يضمن أن الفيروس قد تتغلغل في الأنسجة العصبية المستهدفة المحيطة بها. CED هو نهج فعال لتحقيق مستويات التعبير عالية موحدة عبر مناطق الدماغ الكبيرة في الثدييات. لديها القدرة على توسيع فهمنا للدوائر العصبية والاتصال.
بعد النقل الفيروسي عن طريق CED ، يمكن إقران تجارب التحفيز البصري اللاحقة مع التسجيل الكهربائي والمقالات السلوكية للكشف عن ديناميكيات الدوائر المعقدة داخل الدماغ. وقد سبق أن استخدمت هذه التقنية من قبل Yazdan-Shahmorad وزملاؤه في عام 2018 حيث تم استخدام التعديل العصبي البصري لتحفيز الشبكات لإحداث تغييرات في الاتصال الواسع في القشرة الحركية الحسية.
