Konveksiyon gelişmiş teslimat, ya da CED, insan olmayan primatlar optogenetik viral vektörler, araştırmacılar karmaşık nöral hesaplamalar ve davranışları anlamak için büyük bir ölçekte nöral aktivite işlemek için sağlayacaktır. CED ile primat beyninin büyük bölgelerinde geleneksel yöntemlere göre kısa sürede sadece birkaç enjeksiyon la yüksek optogenetik ekspresyon elde edebiliriz. Manyetik rezonans veya MR uyumlu oda implantasyonu insan olmayan primat ameliyatlarında standart uygulama kullanılarak gerçekleştirilir, prosedür metin protokolünde ayrıntılı olarak anlatılır ve bu videoda kısaca özetlenmiştir.
Metin protokolünde açıklandığı gibi hayvan sedasyonu, konumlandırma ve ilk kesiden sonra, trephine kullanarak enjeksiyonlar için önceden planlanmış yörüngeleri kapsayacak şekilde dairesel bir kraniyotomi oluşturur. Trephine ayarlanabilir merkezleme noktası kullanarak trephine çapa kafatası yeterince derin planlanan kraniyotomi merkezinde bir girintin oluşturun. Merkez yapıldıktan sonra, trephine'i kafatasının üzerine indirin ve kemik kapağı forceps ile çıkarılAna kadar aşağı doğru basınç uygularken trephine'i saat yönünde ve saat yönünün tersine döndürün.
Metin protokolünde ayrıntılı olarak dura kaldırdıktan sonra, kraniyotomi kenarına merkezinden dura kesti ve ince oftalmik makas ile kenar boyunca devam edin. Konveksiyon özel yapılan konveksiyon gelişmiş teslimat MR uyumlu oda kraniotomi üstüne kafatası için bu tür oda flanş eğriliği kafatası eğriliği ile iyi hizalar infüzyon sırasında kanül desteği sağlamak için. İmplantları plastik vidalar ve diş akrilik veya birkaç titanyum vida kullanarak kafatasına sabitleyin.
MR uyumlu haznesini yerleştirdikten ve kanül enjeksiyon ızgarasını odaya yerleştirdikten kısa bir süre sonra, MR anatomik görüntüler aracılığıyla enjeksiyon yerlerini görselleştirmek için ızgarayı %0,9 tuzlu suyla doldurun. Ayrıca beynin nemini korumak için ıslak steril emilebilir jel köpük ile oda boşlukları doldurun. Taşıma ve MR infüzyonu sırasında silindirlerin sterilliğini korumak için cildi ve silindiri steril bir antimikrobiyal eğim perdeile kaplayın.
Pozitif tanımlama için enjeksiyon ızgarasının üst ünü işaretlemek için Bir E vitamini kapsülü yerleştirin. Hayvan entübe kalırken, anestezi devresinden endotrakeal tüp ayırmak ve taşınabilir bir MR uyumlu isoflurane makineye yeniden takın. Hayvanı MR Tarayıcısına götürün.
Enjeksiyon ızgarasının üst kısmından ve kortikal yüzeyden uzaklığı hesaplamak için T1 görüntüleri edinin. E vitamini kapsülaçıkça T1 görüntülerde görülebilir ve enjeksiyon ızgara üst için bir belirteç olarak kullanılmalıdır. Hedeflenen infüzyon bölgesine göre her site için en uygun kanül kılavuzlarını belirlemek için T2 görüntüleri edinin.
Kanül ızgarası, T2 görüntülerinde en iyi görünen tuzlu suyla doldurulur. MR görüntüleme yazılımını kullanarak, infüzyonun hedef konumunu bulmak için koronal ve sagital düzlemlerde ilerleyin. Oda sıcaklığında birkaç saat viral vektör eritme sonra, pipet veya girdap karıştırma ile MR kontrast ajan gadoteridol ile viral vektör karıştırın.
Karışık virüsü 0.2 mililitreyüksek basınçlı IV tüpe yükleyin. Yüksek basınçlı IV tüp kullanarak, uzun bir uzatma hattını MR uyumlu üç mililitreşile şırınga ve salin ile asal olarak bağlayın. Uzun uzatma borularının diğer ucunu virüs yüklü 0.2 mililitrelik IV boruya bağlayın.
Daha sonra bir mililitre adımlı ucu ile reflüye dayanıklı kanül bir kelepçe tarzı kateter konektörü ile bu montaj distal ucuna takın. Son olarak şırıngayı MR uyumlu bir pompaya ayarlayın. Elde edilen temel anatomik MR görüntülerini kullanarak, hedef infüzyon bölgesine ulaşmak için gerekli kanül enjeksiyon ızgara sıyrık konumunu ve ekleme derinliğini seçin.
Steril bant kullanarak kanülün üzerine ekleme derinliğini işaretleyin. Dakikada bir mikrolitre hızında infüzyon alabilirsiniz ve kanül ucundan sıvı nın ejeksiyon gözlemleyerek infüzyon hattında sıvı akışını görsel olarak doğrulayın. Bu ekleme sırasında kanül tıkanmasını nüfuz doku engelleyecek gibi infüzyon hattında akış korurken hedef derinliğine enjeksiyon ızgara sıaracılığıyla kanül elle yerleştirin.
Şimdi viral vektör infüzyon online izleme için hızlı flaş T1 ağırlıklı görüntüler elde. Vektörün yaklaşık 10 mikrolitresini, MR tarayıcısında tespit etmek için yeterli virüs aşılanmış şekilde aşıladıktan sonra, virüsün gözlenen yayılmasında belirgin olarak doğru kanül yerleşimini doğrulamak için MR görüntüleri elde edin. Eklenen kanülün derinliği yanlışsa, derinliği buna göre veya yavaşça kanülü çıkarın ve eklemeyi yeniden dene.
Çevrimiçi MR görüntülerinin rehberliğinde infüzyonu izleyin. Dakikada bir mikrolitre dakikada bir mikrolitre ile dakikada beş mikrolitre infüzyon oranını artırın. Yüksek infüzyon oranları doku hasarına neden olabilir gibi yavaş yavaş infüzyon oranını artırmak ve dakikada beş mikrolitre aşmamak önemlidir.
Viral vektörün yaklaşık 40 mikrolitresini aşıladıktan sonra, infüzyon hızını dakikada bir mikrolitre azaltmaya başlar. Yaklaşık 50 mikrolitre enjekte edildikten sonra infüzyonu durdurun. Kanülleri on dakika bekletin.
Yavaşça beyinden kanül çıkarın ve bir sonraki konuma taşımak. Hayvan taşımadan önce enjeksiyonların sonunda silindiri steril bir perdeile kapatın, ardından hayvanı ameliyathaneye geri götürün. Seri koronal kesitler üzerinde yapılan histolojik analizler infüzyon bölgeleri etrafında büyük ölçekli optogenetik ekspresyon ortaya koymaktadır.
Burada gösterilen temel koronal MR görüntü ve aynı MR koronal dilim için infüzyon sonra kontrast madde nin yayılması. Bir koronal doku bölümü yaklaşık aynı gösterilir. Peroksidaz boyama sarı floresan protein veya EYFP muhabiri nin ifadesini yansıtır.
Yüzey epifluorescense ve histolojik boyama ile ölçülen EYFP ekspresyonu alanı arasında iyi bir uyum gözlenir. Bunlar, MR görüntülerinden tahmin edilen vektör yayılımı bölgesini içerir. Beyaz noktalar enjeksiyon bölgelerini gösterir ve tüm siyah bölge kraniyotominin maruz kaçtığı bölgeyi temsil eder.
Burada gösterilen somatosensoriyel kortekste YFP ekspresyonunun medial lateral yönünü gösteren anti GFP antikor ile boyanmış koronal kesitlerin düşük büyütme görüntüsüdür. Siyah ok ucu kanül yolunun konumunu gösterir. YFP pozitif hücrelerin laminar dağılımını göstermek için bitişik doku daha büyük büyütme gösterilir.
YFP pozitif hücrelerin yoğun nüfuslu bölgeleri ağırlıklı olarak katmanlar iki ile üç ve beş ile altı arasında yer almaktadır. Daha fazla genişleme katmanları iki ile üç, katman beş ve katman altı tipik piramidal hücreleri ortaya koymaktadır. Akış durduktan sonra kanülden 10 dakika boyunca yerinde bırakmak önemlidir.
Bu, virüsün çevredeki hedefli sinir dokusuna nüfuz edilmesini sağlayacaktır. CED memelilerde büyük beyin bölgeleri arasında düzgün yüksek ifade düzeyleri elde etmek için etkili bir yaklaşımdır. Nöral devreler ve bağlantı anlayışımızı genişletme potansiyeline sahiptir.
CED ile viral transdüksiyon sonra, sonraki optogenetik stimülasyon deneyleri beyin içinde karmaşık devre dinamikleri ortaya çıkarmak için elektrik kayıt ve davranışsal denemeler ile eşleştirilmiş olabilir. Bu teknik daha önce Yazdan-Shahmorad ve meslektaşları tarafından 2018 yılında, duyusal motor kortekste ağ geniş bağlantı değişikliklerini tetiklemek için optogenetik nöral modülasyon kullanılmıştır.
