비 인간 영장류에 있는 광유전학 바이러스 벡터의 대류 향상한 납품, 또는 CED는 연구원이 복잡한 신경 계산 및 행동을 이해하기 위하여 대규모로 신경 활동을 조작하는 것을 가능하게 할 것입니다. CED를 사용하면 전통적인 방법에 비해 짧은 시간에 몇 번의 주사만으로 영장류 뇌의 큰 영역에 걸쳐 높은 광유전학 적 발현을 달성 할 수 있습니다. 자기 공명 또는 MR 호환 챔버 이식은 비 인간 영장류 수술에서 표준 관행을 사용하여 수행되며, 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 이 비디오에서 간략하게 설명된다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 동물 진정, 위치 지정 및 초기 절개에 따라, 트레핀을 사용하여 주사에 대한 미리 계획된 궤적을 커버하는 원형 두개통절제술을 생성한다. 트레핀의 조절 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정하기 위해 두개골 깊숙이 계획된 두개골 절제술의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 센터가 만들어지면 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 반대 방향으로 회전시키면서 골격 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하방 압력을 가합니다.
텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 두라를 들어 올린 후 두라를 중앙에서 두개골 절제술의 가장자리로 자르고 미세한 안과 가위로 가장자리를 따라 계속합니다. 원통형 관습을 탑재하여 두개골 위에 있는 두개골에 전달 MR 호환 챔버를 강화하여 챔버 플랜지의 곡률이 두개골곡과 잘 정렬되는 주입은 주포 중에 캐뉼라 지원을 제공합니다. 플라스틱 나사와 치과 아크릴 또는 몇 티타늄 나사를 사용하여 두개골에 임플란트를 고정하십시오.
MR 호환 챔버를 이식하고 챔버에 캐뉼라 주입 그리드를 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주입 위치를 시각화하기위한 0.9 % 식염수로 그리드를 채웁니다. 또한 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수성 젤 폼으로 챔버 구멍을 채웁니다. 수송 및 MR 주입 시 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이프로 피부와 실린더를 덮습니다.
비타민 E 캡슐을 배치하여 주사 그리드의 상단을 표시하여 긍정적인 식별을 합니다. 동물이 삽관된 상태로 남아 있는 동안 마취 회로에서 내트라큐리 튜브를 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 부착합니다. 동물을 MRI 스캐너로 운반합니다.
T1 이미지를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단에서의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의 상단에 대한 마커로 사용해야합니다. T2 이미지를 획득하여 주입 대상 부위를 기반으로 각 부위에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다.
캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 볼 수 있는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 좌활 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다. 실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 피펫 또는 소용돌이 혼합에 의해 MR 조영제 가도테돌과 바이러스 벡터를 혼합한다.
혼합 바이러스를 0.2 밀리리터 고압 IV 튜브에 적재합니다. 고압 IV 튜브를 사용하여 긴 연장 라인을 MR 호환 3 밀리리터 주사기에 연결하고 식염수와 프라임하십시오. 바이러스가로드 된 0.2 밀리리터 IV 튜브에 긴 확장 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다.
그런 다음 1 밀리리터 스노단 팁으로 역류 저항 캐뉼라를 클램프 스타일 카테터 커넥터로 이 어셈블리의 단부 끝에 부착합니다. 마지막으로 MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다. 얻어진 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 사출 그리드 위치 및 삽입 깊이를 선택합니다.
멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라의 삽입 깊이를 표시합니다. 분당 1마이크로리터의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증합니다. 주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 캐뉼라를 삽입하여 삽입 중에 침투된 조직이 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.
이제 바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을위한 빠른 플래시 T1 가중 이미지를 습득. MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되는 벡터의 약 10 마이크로리터를 주입한 후, 관찰된 바이러스 확산에 의해 명백한 정확한 캐뉼라 배치를 확인하기 위해 MR 이미지를 얻습니다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 깊이를 적절히 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 삽입을 다시 시도합니다.
온라인 MR 이미지의 지침을 통해 주입을 모니터링합니다. 분당 마이크로리터를 분당 1단계로 분당 5마이크로리터로 늘리는 데 몇 분마다 주입 속도를 높입니다. 주입 속도를 천천히 높이고 높은 주입 속도가 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 분당 5 마이크로 리터를 초과하지 않는 것이 중요합니다.
바이러스 벡터의 약 40 마이크로리터를 주입한 후 분당 1마이크로리터로 주입 속도를 감소시키기 시작합니다. 약 50 마이크로리터가 주입된 후 주입을 중단하십시오. 캐뉼라를 10분 동안 제자리에 둡니다.
천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 동물 수송 전에 주사의 끝에 멸균 커튼으로 실린더를 덮고, 수술실로 다시 동물을 수송합니다. 직렬 관상 학문 섹션에 대한 조직학적 분석은 주입 부위 의 주위에 대규모 광유전학 적 발현을 드러낸다.
여기에 표시된 기준관상 MR 이미지와 동일한 MR 코로나 슬라이스에 대한 주입 후 조영제의 확산이 도시되어 있다. 관상 조직 섹션은 거의 동일한 에서 표시됩니다. 과록시다제 염색은 황색 형광 단백질 또는 EYFP 리포터의 발현을 반영한다.
좋은 정렬은 EYFP 발현의 영역 사이 관찰되며, 표면 에피플루오레스향과 조직학적 염색으로 측정됩니다. 여기에는 MR 이미지에서 추정된 벡터 스프레드 영역이 포함됩니다. 흰색 점은 주입 부위를 나타내고 전체 검은 색 영역은 두개골 절제술에 의해 노출 된 영역을 나타냅니다.
여기에 도시된 관상부 단면도의 낮은 배율 이미지는 색소 감각 피질에서 YFP 발현의 내측 측면 측면을 나타내는 항GFP 항체로 염색된다. 검은색 화살표헤드는 캐뉼라 트랙의 위치를 나타냅니다. 인접한 조직은 YFP 양성 세포의 라미나르 분포를 보여주기 위해 더 큰 배율로 나타난다.
YFP 양성 세포의 인구 밀도가 높은 영역은 주로 2~3층과 5층에서 6층으로 위치하고 있다. 추가 확대는 2층에서 3층, 층 5층 및 층 6층에서 전형적인 피라미드 세포를 드러낸다. 흐름이 중지된 후 10분 동안 캐뉼라를 제자리에 두는 것이 중요합니다.
이것은 바이러스가 주변 표적 신경 조직으로 침투했다는 것을 보장할 것입니다. CED는 포유류의 큰 뇌 영역에서 균일하게 높은 발현 수준을 달성하기 위한 효율적인 접근법입니다. 그것은 신경 회로와 연결에 대한 우리의 이해를 확장 할 수있는 잠재력을 가지고.
CED에 의한 바이러스 성 트랜스듀션 후, 후속 광유전학 자극 실험은 전기 기록 및 행동 에세이와 결합하여 뇌 내의 복잡한 회로 역학을 드러낼 수 있습니다. 이 기술은 이전에 야즈단 샤모라드와 동료에 의해 사용되었습니다 2018 있는 광유전학 신경 변조는 감각 모터 피질에 있는 네트워크 넓은 연결 변경을 유도하기 위하여 이용되었습니다.
