משלוח משופר הסעה, או CED, של וקטורים ויראליים אופטוגנטיים אצל פרימטים שאינם אנושיים יאפשר לחוקרים לתפעל פעילות עצבית בקנה מידה גדול כדי להבין חישובים עצביים מורכבים והתנהגויות. עם CED אנו יכולים להשיג ביטוי אופטוגנטי גבוה על פני אזורים גדולים של המוח הפרימט עם רק כמה זריקות בזמן קצר לעומת שיטות מסורתיות. תהודה מגנטית או השתלת תא תואמת MR מבוצעת באמצעות תרגול סטנדרטי בניתוחי פרימטים שאינם אנושיים, ההליך מתואר בפירוט בפרוטוקול הטקסט ומתואר בקצרה בסרטון זה.
לאחר הרדמה, מיקום וחתך ראשוני של בעלי חיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, צור גולגולת מעגלית כדי לכסות את המסלולים התצורתיים מראש לזריקות באמצעות טרפין. צור חריץ במרכז הגולגולת המתוכננת עמוק מספיק בגולגולת כדי לעגן את הטרפין באמצעות נקודת מרכוזה מתכווננת של הטרפין. לאחר המרכז נעשה, להוריד את trephine על הגולגולת ולסובב את trephine בכיוון השעון נגד כיוון השעון תוך הפעלת לחץ כלפי מטה עד מכסה העצם ניתן להסיר עם מלקחים.
לאחר הרמת דורה כמפורט בפרוטוקול הטקסט, חותכים את הדורא מהמרכז לקצה הגולגולת וממשיכים לאורך הקצה עם מספריים עיניים עדין. הר את מותאם אישית גלילי עשה הסעה משופרת משלוח MR תא תואם לגולגולת על גבי craniotomy כדי לספק תמיכה קנולה במהלך עירוי, כך העקמומיות של אוגן התא מתיישר היטב עם העקמומיות של הגולגולת. אבטחו את השתלים לגולגולת באמצעות ברגים מפלסטיק ואקריליק דנטלי או כמה ברגים של טיטניום.
זמן קצר לאחר השתלת התא תואם MR והכנסת רשת הזרקת cannula לתוך התא, למלא את הרשת עם 0.9% מלוחים להדמיית מיקומי ההזרקה באמצעות תמונות אנטומיות MR. גם למלא את חללי התא עם קצף ג'ל סטרילי רטוב לספוג כדי לשמור על הלחות של המוח. מכסים את העור ואת הצילינדר עם וילון חרוט מיקרוביאלי סטרילי כדי לשמור על סטריליות של הצילינדרים במהלך הובלה וחליטות MR.
מניחים כמוסה ויטמין E כדי לסמן את החלק העליון של רשת ההזרקה לזיהוי חיובי. בעוד החיה נשארת צנרר, לנתק את הצינור האנדוטראצ'י ממעגל ההרדמה ולצרף אותו מחדש למכונת isoflurane תואמת MR ניידת. להעביר את החיה לסורק MRI.
לרכוש תמונות T1 כדי לחשב את המרחק מהחלק העליון של רשת ההזרקה ואת פני השטח קליפת המוח. כמוסת ויטמין E נראית בבירור בתמונות T1 ויש להשתמש בה כסמן לראש רשת ההזרקה. לרכוש תמונות T2 כדי לקבוע את המדריכים cannula אופטימלית עבור כל אתר מבוסס על האתר הממוקד של עירוי.
רשת ה Cannula מלאה מלוחים אשר נראה הכי טוב בתמונות T2. באמצעות תוכנת ההדמיה MR, גללו במישורי קורונדל וסגיטל כדי למצוא את מיקום היעד של העירוי. לאחר הפשרת וקטור ויראלי במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, מערבבים את הווקטור ויראלי עם סוכן ניגוד MR gadoteridol על ידי פיפלט או ערבוב מערבולת.
לטעון את הנגיף המעורב לתוך צינורות IV בלחץ גבוה 0.2 מיליליטר. באמצעות צינורות IV בלחץ גבוה, לחבר קו הארכה ארוך למזרק MR תואם שלושה מיליליטר וראש עם מלוחים. חבר את הקצה השני של צינורות הארכה ארוכה צינורות 0.2 מיליליטר IV טעון עם הנגיף.
לאחר מכן חבר את ה cannula עמיד ריפלוקס עם קצה צעד מיליליטר אחד לקצה הדיסטלי של הרכבה זו עם מחבר קטטר בסגנון מהדק. לבסוף להגדיר את המזרק במשאבה תואמת MR. באמצעות תמונות MR אנטומיות בסיסיות שהושגו, בחר את מיקום רשת הזרקת הקנולה ואת עומק ההכנסה הדרושים כדי להגיע לאתר עירוי היעד.
סמן את עומק הכניסה על ה Cannula באמצעות סרט סטרילי. התחל את עירוי בקצב של microliter אחד לדקה חזותית לאמת את זרימת הנוזל בקו עירוי על ידי התבוננות פליטת נוזל מן קצה cannula. הכנס את cannula באופן ידני דרך רשת ההזרקה לעומק היעד תוך שמירה על זרימה בקו עירוי כמו זה ימנע את הרקמה חדרה סתימת cannula במהלך הכניסה.
עכשיו לרכוש פלאש מהיר T1 משוקלל תמונות לניטור מקוון של עירוי וקטור ויראלי. לאחר החדרת כ 10 microliters של הווקטור כך וירוס מספיק הוא חדורים כדי לזהות בסורק MR, להשיג תמונות MR כדי לאמת את מיקום cannula הנכון כפי שניתן לראות על ידי התפשטות שנצפו של הנגיף. אם עומק ה cannula שנוסף שגוי, להתאים את העומק בהתאם או לאט להסיר את cannula מחדש את הכניסה.
לפקח על עירוי באמצעות הדרכה של תמונות MR באינטרנט. הגדל את קצב העירוי לחמישה מיקרוליטרים לדקה במיקרוליטר אחד לדקה כל כמה דקות. חשוב להגדיל את קצב העירוי לאט ולא יעלה על חמישה microliters לדקה כמו שיעורי עירוי גבוהים עלולים לגרום נזק לרקמות.
לאחר החדרת כ 40 microliters של וקטור ויראלי, להתחיל להפחית את קצב העירוי על ידי מיקרוליטר אחד לדקה צעדים. לעצור את עירוי לאחר כ 50 microliters מוזרק. השאירו את ה Cannula במקום במשך עשר דקות.
מוציאים לאט את ה cannula מהמוח וע עוברים למקום הבא. מכסים את הצילינדר עם וילון סטרילי בסוף הזריקות לפני הובלת בעלי חיים, ואז להעביר את החיה בחזרה לחדר הניתוח. ניתוחים היסטולוגיים על קטעי קורונדל סדרתיים חושפים ביטוי אופטוגנטי בקנה מידה גדול סביב אתרי העירוי.
מוצגת כאן תמונת MR קורונטל בסיסית והתפשטות סוכן הניגוד לאחר העירוי לאותה פרוסת MR coronal. קטע רקמת קורל מוצג בערך מאותו הדבר. כתמי פרוקסידאז משקפים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב או כתב EYFP.
יישור טוב נצפתה בין האזור של ביטוי EYFP, נמדד עם epifluorescense פני השטח עם כתמים היסטולוגיים. אלה כוללים את האזור של התפשטות וקטור מוערך מתמונות MR. נקודות לבנות מציינות אתרי הזרקה וכל האזור השחור מייצג את האזור שנחשף על ידי הגולגולת.
מוצגת כאן תמונת הגדלה נמוכה של חלקי coronal מוכתמים בנוגדן אנטי GFP המציג את ההיבט הרוחבי המדיאלי של ביטוי YFP בקליפת המוח הסומטוסנסית. ראש החץ השחור מציין את מיקום מסלול הקנה. הרקמה הסמוכה מוצגת בהגדלה גדולה יותר כדי להראות התפלגות למינארית של התאים החיוביים של YFP.
אזורים מאוכלסים בצפיפות של תאים חיוביים YFP ממוקמים בעיקר בשכבות 2 עד 3 ו 5 עד 6. הגדלה נוספת חושפת תאים פירמידליים טיפוסיים בשכבות 2 עד 3, שכבה 5 ושכבה 6. חשוב להשאיר את ה Cannula במקום במשך 10 דקות לאחר הזרימה נעצרה.
זה יבטיח כי הנגיף חלחל לתוך הרקמה העצבית הממוקדת שמסביב. CED היא גישה יעילה להשגת רמות ביטוי גבוהות באופן אחיד על פני אזורי מוח גדולים ביונקים. יש לו פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של מעגלים עצביים וקישוריות.
לאחר התמרה ויראלית על ידי CED, ניסויי גירוי אופטוגנטיים הבאים ניתן לזווג עם הקלטה חשמלית ומסות התנהגותיות כדי לחשוף את הדינמיקה מעגל מורכב בתוך המוח. טכניקה זו הועסקה בעבר על ידי יזדן-Shahmorad ועמיתיו בשנת 2018 שבו אפנון עצבי אופטוגנטי שימש כדי לגרום לשינויים קישוריות רחבה ברשת בקליפת המוח המוטורית החושית.
