Конвекция расширенной доставки, или CED, оптогенетических вирусных векторов у не человеческих приматов позволит исследователям манипулировать нейронной активностью в больших масштабах, чтобы понять сложные нейронные вычисления и поведение. С CED мы можем достичь высокой оптогенетической экспрессии в больших областях мозга приматов только с несколькими инъекциями в короткий промежуток времени по сравнению с традиционными методами. Магнитно-резонансная или MR совместимая камерная имплантация выполняется с использованием стандартной практики в не человеческих операциях приматов, процедура подробно описана в текстовом протоколе и кратко изложена в этом видео.
После лечения животных, позиционирования и первоначального разреза, как описано в текстовом протоколе, создайте круговую краниотомию, чтобы покрыть заранее спланированные траектории для инъекций с помощью трефина. Создайте отступ в центре запланированной краниотомии достаточно глубоко в черепе, чтобы закрепить трефин с помощью регулируемой точки центрирования трефина. После того, как центр был сделан, опустите трефин на череп и поверните трефин по часовой стрелке и против часовой стрелки при применении понижательного давления, пока костная крышка может быть удалена с типсами.
Подняв дуру, как описано в текстовом протоколе, вырежьте дуру от центра до края краниотомии и продолжайте по краю с мелкими офтальмологическими ножницами. Гора цилиндрической обычай сделал конвекции расширенной доставки MR совместимой камеры к черепу на верхней части краниотомии, чтобы обеспечить поддержку канюли во время инфузии так, что кривизна камеры фланг хорошо выравнивается с кривизной черепа. Защитите имплантаты к черепу, используя либо пластиковые винты и зубной акрил или несколько титановых винтов.
Вскоре после имплантации MR совместимой камеры и вставки сетки впрыска канюли в камеру, заполнить сетку с 0,9% солевого раствора для визуализации места инъекций через MR анатомических изображений. Также заполните камерные полости влажной стерильной абсорбируемой гелеобразной пеной для поддержания влажности мозга. Обложка кожи и цилиндра с стерильной антимикробной инкизировки для поддержания стерильности цилиндров во время транспортировки и М. инфузии.
Поместите капсулу витамина Е, чтобы отметить верхнюю часть сетки инъекций для положительной идентификации. В то время как животное остается интубировано, отсоедините эндотрахеаную трубку от цепи анестезии и прикрепите ее к портативной совместимой с MR изофлюрановой машине. Транспорт животное к МРТ сканера.
Приобретайте изображения T1 для расчета расстояния от верхней части сетки впрыска и поверхности кортика. Капсула витамина Е хорошо видна на снимках Т1 и должна использоваться в качестве маркера для верхней части сетки для инъекций. Приобрети изображения T2 для определения оптимальных руководств канюлей для каждого участка на основе целевого участка инфузии.
Сетка канюли наполнена солевым раствором, который лучше всего виден на изображениях T2. Используя программное обеспечение для визуализации MR, прокрутите корональные и sagittal плоскости, чтобы найти целевое местоположение вливания. После оттаивания вирусного вектора в течение нескольких часов при комнатной температуре, смешать вирусный вектор с MR контрастным агентом gadoteridol по пипетке или вихревой смешивания.
Загрузите смешанный вирус в 0,2 миллилитра высокого давления IV трубки. Используя трубки с высоким давлением IV, подключите длинную линию расширения к совместимому с MR трехми миллилитровому шприцу и премьеру с солевым раствором. Подключите другой конец длинной трубки расширения к трубе 0,2 миллилитра IV, загруженной вирусом.
Затем приложите рефлюкс устойчивый канюла с одним миллилитров шагнул отзыв на дистальный конец этой сборки с разъемом катетера стиле зажима. Наконец установить шприц в MR совместимый насос. Используя полученные базовые анатомические изображения MR, выберите расположение сетки впрыска канюли и глубину вставки, необходимую для достижения целевого места вливания.
Отметьте глубину вставки на канюле с помощью стерильной ленты. Начните вливание со скоростью одного микролитер в минуту и визуально проверить поток жидкости в линии инфузии, наблюдая выброс жидкости из кончика канюли. Вставьте канюлю вручную через сетку впрыска на целевую глубину, сохраняя при этом поток в линии инфузии, так как это предотвратит проникновение ткани от засорения канюли во время вставки.
Теперь приобрети быстрые флэш T1-взвешенные изображения для онлайн-мониторинга вирусного векторного вливания. После вливая около 10 микролитров вектора таким образом, что достаточно вируса вливается для обнаружения в сканере MR, получить MR изображения для проверки правильного размещения канюли, как видно из наблюдаемого распространения вируса. Если глубина вставленной канюли неверна, отрегулируйте глубину соответствующим образом или медленно удалите канюлю и повторно извещайте вставку.
Мониторинг вливания с помощью руководства онлайн MR изображений. Увеличьте скорость вливания до пяти микролитров в минуту на один микролитер в минуту шагов каждые несколько минут. Важно, чтобы увеличить скорость инфузии медленно и не превышать пять микролитров в минуту, как высокие показатели инфузии может привести к повреждению тканей.
После вливания примерно 40 микролитров вирусного вектора, начните снижать скорость вливания на один микролитер в минуту шагов. Остановите настой после введения примерно 50 микролитров. Оставьте канюлю на месте на десять минут.
Медленно удалить канюлю из мозга и перейти к следующему месту. Обложка цилиндра с стерильной драпировки в конце инъекций перед перевозкой животных, а затем транспортировать животное обратно в операционную. Гистологические анализы серийных корональных секций показывают крупномасштабное оптогенетическое выражение вокруг инфузионных участков.
Здесь показан базовый корональная MR-изображение и распространение контрастного агента после инфузии для того же короналя MR. Раздел корональной ткани показан примерно из того же. Окрашивание пероксидазы отражает экспрессию желтого флуоресцентного белка или репортера EYFP.
Хорошее выравнивание наблюдается между областью выражения EYFP, измеряется поверхностным эпифлюоресцентом и гистологическим окрашиванием. К ним относится область векторного распространения, оцененная на основе MR-изображений. Белые точки указывают на места инъекций, а вся черная область представляет область, подвергаемую краниотомии.
Здесь показано низкое увеличение изображения корональных секций, окрашенных анти-антителами GFP, показывающими медиальный боковой аспект экспрессии YFP в соматосенсной коре. Черная наконечник стрелы указывает местоположение трассы канюли. Прилегающая ткань показана при большем увеличении, чтобы показать ламинарное распределение положительных клеток YFP.
Плотно заселенные районы положительных ячеек YFP расположены преимущественно в слоях от двух до трех и от пяти до шести. Дальнейшее расширение показывает типичные пирамидальные клетки в слоях два-три, слой пять и слой шесть. Важно оставить канюлю на месте в течение 10 минут после того, как поток остановился.
Это гарантирует, что вирус пронизыв в окружающих целевых нервной ткани. CED является эффективным подходом для достижения равномерно высокого уровня экспрессии в крупных областях мозга у млекопитающих. Он имеет потенциал, чтобы расширить наше понимание нейронных цепей и подключения.
После вирусной трансдукции CED, последующие эксперименты оптогенетической стимуляции могут быть в паре с электрической записи и поведенческие эссе, чтобы выявить сложную динамику цепи в головном мозге. Этот метод ранее использовался Яздан-Шахморад и его коллегами в 2018 году, в котором оптогенетическая нейронная модуляция использовалась для индуцирования сетевых изменений широкой связи в сенсорной моторной коре.
