La convección mejorada entrega, o CED, de vectores virales optogenéticos en primates no humanos permitirá a los investigadores manipular la actividad neuronal a gran escala para entender los cálculos y comportamientos neuronales complejos. Con CED podemos lograr una alta expresión optogenética a través de grandes regiones del cerebro de primate con sólo unas pocas inyecciones en un corto período de tiempo en comparación con los métodos tradicionales. La resonancia magnética o la implantación de cámara compatible con RMN se realiza utilizando la práctica estándar en cirugías de primates no humanos, el procedimiento se describe en detalle en el protocolo de texto y se describe brevemente en este video.
Después de la sedación animal, posicionamiento e incisión inicial como se describe en el protocolo de texto, crear una craneotomía circular para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando una tretelina. Crea una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profunda en el cráneo para anclar la tretina usando el punto de centrado ajustable de la tretina. Una vez que se ha hecho el centro, baje la trephine sobre el cráneo y gire la tretela en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión hacia abajo hasta que la tapa ósea se pueda quitar con fórceps.
Después de levantar la dura como se detalla en el protocolo de texto, cortar la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continuar a lo largo del borde con finas tijeras oftálmicas. Monte la cámara compatible con RM de entrega mejorada de convección hecha a medida cilíndrica al cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo. Fije los implantes al cráneo usando tornillos de plástico y acrílico dental o unos pocos tornillos de titanio.
Poco después de implantar la cámara compatible con RM e insertar la rejilla de inyección de cánula en la cámara, llene la rejilla con 0,9% de solución salina para visualizar las ubicaciones de inyección a través de imágenes anatómicas de RMN. También llene las cavidades de la cámara con espuma de gel estéril húmeda absorbible para mantener la humedad del cerebro. Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM.
Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva. Mientras el animal permanece intubado, desprende el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RMN portátil. Transporte al animal al escáner de resonancia magnética.
Adquiera imágenes T1 para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en las imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección. Adquiera imágenes T2 para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del sitio específico de la perfusión.
La cuadrícula de cánulas está llena de solución salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión. Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el agente de contraste MR gadoteridol por pipeta o mezcla de vórtice.
Cargue el virus mezclado en tubo IV de alta presión de 0,2 mililitros. Con tubo IV de alta presión, conecte una línea de extensión larga a una jeringa de tres mililitros compatible con RMN y cebada con solución salina. Conecte el otro extremo del tubo de extensión larga al tubo de 0,2 mililitros IV cargado con el virus.
A continuación, coloque la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de un mililitro en el extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera. Por último, ajuste la jeringa en una bomba compatible con MR. Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo.
Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril. Comience la perfusión a una velocidad de un microlitro por minuto y valide visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido de la punta de la cánula. Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección hasta la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.
Ahora adquiera imágenes ponderadas T1 flash rápido para la monitorización en línea de la infusión vectorial viral. Después de infundir aproximadamente 10 microlitros del vector de tal manera que se infunda suficiente virus para detectar en el escáner de RMN, obtenga imágenes de RMN para verificar la correcta colocación de la cánula como es evidente por la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción.
Supervise la perfusión mediante la guía de imágenes de RM en línea. Aumente la velocidad de perfusión a cinco microlitros por minuto en un microlitro por minuto cada pocos minutos. Es importante aumentar lentamente la velocidad de perfusión y no exceder cinco microlitros por minuto, ya que las altas tasas de perfusión podrían causar daño tisular.
Después de infundir aproximadamente 40 microlitros del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en un microlitro por minuto pasos. Detenga la perfusión después de inyectar aproximadamente 50 microlitros. Deje la cánula en su lugar durante diez minutos.
Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones antes del transporte animal, luego transporte al animal de vuelta al quirófano. Los análisis histológicos en secciones coronales en serie revelan una expresión optogenética a gran escala alrededor de los sitios de perfusión.
Aquí se muestra la imagen de RM coronal basal y la propagación del agente de contraste después de la perfusión para la misma rebanada coronal de RM. Una sección del tejido coronal se muestra aproximadamente de la misma. La tinción de peroxidasa refleja la expresión de la proteína fluorescente amarilla o del reportero de EYFP.
Se observa una buena alineación entre el área de expresión EYFP, medida con epifluorescensa superficial y con tinción histológica. Estos incluyen la región de propagación vectorial estimada a partir de imágenes de RM. Los puntos blancos indican los sitios de inyección y toda la región negra representa el área expuesta por la craneotomía.
Aquí se muestra una imagen de bajo aumento de las secciones coronales manchadas con anticuerpos anti GFP que muestran el aspecto lateral medial de la expresión de YFP en la corteza somatosensorial. La punta de flecha negra indica la ubicación de la pista de cánula. El tejido adyacente se muestra con un mayor aumento para mostrar la distribución laminar de las células positivas de YFP.
Las regiones densamente pobladas de células positivas de YFP se encuentran predominantemente en las capas de dos a tres y cinco a seis. El agrandamiento adicional revela celdas piramidales típicas en las capas dos a tres, la capa cinco y la capa seis. Es importante dejar la cánula en su lugar durante 10 minutos después de que el flujo se haya detenido.
Esto asegurará que el virus se haya percolado en el tejido neural objetivo circundante. CED es un enfoque eficiente para lograr niveles de expresión uniformemente altos en grandes regiones cerebrales en mamíferos. Tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de los circuitos neuronales y la conectividad.
Después de la transducción viral por CED, los experimentos de estimulación optogenética posteriores se pueden emparejar con la grabación eléctrica y ensayos conductuales para revelar la dinámica de circuito complejo dentro del cerebro. Esta técnica ha sido empleada previamente por Yazdan-Shahmorad y sus colegas en 2018 en la que se utilizó la modulación neuronal optogenética para inducir cambios de conectividad en toda la red en la corteza motora sensorial.
