يقدم هذا البروتوكول طريقة لتحسين وظيفة القلب في فئران ضمور العضلات في دوشين عن طريق زرع إكسون المستمدة من الخلايا السابقة لليوجينيك العادية. يمكن أن يحسن زرع الإزوم وظائف القلب في فئران DMD بالاشتراك مع زيادة التعبير عن ضمور في قلوب المتلقي. تساهم الطريقة المناسبة لعزل الطاردات وتنقيتها وزرعها داخل القلب في نجاح عملية زرع الطاردة من أجل تحسين وظيفة القلب للفئران التي تحتوي على ضمور العضلات في دوشين.
قد العلاج exosome المستمدة من لجنة السياسة النقدية تحسين وظيفة العضلات والهيكل العظمي عن طريق الإكسوسوم بوساطة طبيعية دستروفين نقل مرنا. يوضح هذا الفيديو التقنيات الهامة لتنقية السوسات، وتسليم الزوم داخل القلب، وتصوير صدى القلب بعد الزرع. عرض تخطيط صدى القلب سيتم من قبل يان شين، فني من مختبرنا.
لبدء هذا الإجراء، بذور خمسة ملايين الخلايا C2C12 في طبق ثقافة 15 سم مع 20 ملليلتر من DMEM كاملة تحتوي على 10٪ FBS والمضادات الحيوية. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، استخدم دوار دلو متأرجح إلى FBS فائق التركيز عند 100، 000 مرة G وعند أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة لإعداد متوسطة مستنفدة من الكوسوم.
تجاهل بيليه وجمع ناظر. عندما تصل الخلايا أحادية الطبقة إلى 80٪ التقاء في طبق الثقافة، استبدال DMEM كاملة مع المتوسطة المنضب exosome. استخدام ماصة نقل لجمع افرا من طبق ثقافة الخلية كل 48 ساعة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 150 مرة G لمدة عشر دقائق لإزالة الخلايا المتبقية. تصفية فائقة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للقضاء على أي حطام الخلية ونقل المتوسطة المصفاة إلى أنابيب فائقة الوضوح. بعد ذلك، استخدم دوار دلو سوينغ إلى الrifuge أنابيب في 100، 00 مرات G و 4 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة لتسريع exosomes.
Resuspend الكريه التي تحتوي على exosome في برنامج تلفزيوني ومن ثم ملء أنبوب كامل فائقة واضحة مع برنامج تلفزيوني. فائقة التركيز يريفوج هذا التعليق في 100، 00 مرات G و 4 درجات مئوية لمدة 120 دقيقة للقضاء على البروتينات الملوثة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه exosome في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
تخزين في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. أولاً، قم بإصلاح كل فأر مُجرّد تخدير في موضع الوَيُبِي على منصة جراحية عن طريق تأمين كل طرف بشريط. ضع خياطة 3-0 أفقيًا أسفل الأسنان العلوية للاحتفاظ بالفك العلوي في مكانه.
بعد ذلك، ضعي كريم إزالة الشعر على الجانب الأيسر من صدر الفأر لإزالة التنوب من الجلد. باستخدام قسطرة قياس 24، أداء الاحتضان البطاية عن طريق تجويف الفم. واستخدام جهاز التنفس الصناعي القوارض لتهوية الماوس مع هواء الغرفة بمعدل 195 نفسا في الدقيقة الواحدة.
تطهير الجلد مع 70٪ الكحول و 10٪ povidone اليود. ثم جعل شق من 10 إلى 15 ملليمتر مائل من الحافة القبطية اليسرى إلى الإبط الأيسر. استخدام مقص لقطع الزهيري الرئيسي والصغرى الصدرية.
وجعل thoracotamy اليسار من خلال الفضاء بين الكوستال الرابع. أدخل برفق شرائط الداحبة لنشر التجويف الصدري إلى عرض 10 ملليمترات مع الحرص على عدم تلف الرئة اليسرى. بعد ذلك، استخدمي ملاقطتين مستقيمتين لإزالة المُعايَر.
سحبها بعيدا ووضعها وراء نصائح الداهم لفضح القلب. استخدام إبرة الأنسولين قياس 31 لحقن إما MPC-Exo أو PBS intramyocardially في الجدار الأمامي للبطين الأيسر في موقع واحد. ثم، استخدام خياطة النايلون 6-0 لإغلاق تجويف الصدر، والعضلات الصدرية، والجلد، في تسلسل.
بعد يومين من زرع إكسوسومات PBS ، تخدير الفئران كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم الشريط لإصلاح الماوس في موضع الوبين وتطبيق الجل الصوتي المُحمّى مسبقًا على منطقة الصدر الأيسر. بعد ذلك، استخدم تخطيط صدى القلب لتقييم وظيفة البطين الأيسر.
الحصول على عرض محور طويل parasternal من البطين الأيسر في بعدين ثم تدوير مسبار الموجات فوق الصوتية 90 درجة للحصول على عرض المحور القصير البطين الأيسر على مستوى العضلات الحليمية. بعد ذلك، قم بتسجيل الصور الصدى في وضع M وقياس القطر الأيسر للنهاية البطينية الانبساطية، وحجم نهاية البطين البطيني الأيسر، وحجم الانبساطي البطيني الأيسر، وحجم البطينين البطيني الانقباضي الأيسر. يجب التحكم في معدل ضربات القلب للفئران على الأقل 400 bpm لوظيفة قياس القلب.
بعد عزل ونقاء السوسسومات من الخلايا C2C12، يتم تأكيد وجودها باستخدام التحليل المجهري للإلكترون انتقال. تُظهر صورة المجهر الإلكتروني المُنقلة مورفولوجيا الحويصلات الساطعة المستديرة على شكل شكل إكسوزومات مشتقة من C2C12. تحليل البقعة الغربية يؤكد وجود علامات إكسوسومات بما في ذلك CD63 و Tsg101.
لوحظت منطقة ذمة شفافة بعد الحقن داخل القلب في الجدار الأمامي للبطين الأيسر من الفئران mdx مما يشير إلى أن الحقن في عضلة القلب ناجح. يتم تنفيذ تلوين مناعي للديستروفين لتحديد ما إذا كان تسليم MPC-Exo القلب يعيد التعبير بروتين ديستروفين في قلوب mdx. لوحظ استعادة جزئية للتعبير ديستروفين مع توطين الغشاء في بعض من cardiomyocytes.
تقاس وظيفة القلب عن طريق تخطيط صدى القلب بعد يومين من الولادة داخل القلب لتحديد ما إذا كان نقل MPC-Exo يحسن وظيفة القلب في الفئران MDX. وينظر إلى العلاج MPC-Exo لتحسين حركة الجدار الداخلي مقارنة مع برنامج تلفزيوني، مما يشير إلى أن MPC-Exo زرع تحسين وظيفة القلب في الفئران MDX. استخدام إبرة الأنسولين قياس 31 مع طرف في حوالي 20 درجة أمر بالغ الأهمية لنجاح تسليم معظم الإكسوسومات في عضلة القلب ويزيد من التعرض للاكسوسوس حقن لاستضافة عضلة القلب.
بعد الإجراء, يمكن الكشف عن تعبير ديستروفين بعد حقن اكسوسوسوم المستمدة من MPC عن طريق تلطيخ مناعي مما يدل على أن القلب MPC المستمدة من الاكوسوزومات تسليم يعيد التعبير ديستروفين البروتين. هذه التقنية سوف تمهد الطريق لعلاج اعتلال عضلة القلب مع المواد الوراثية العلاجية الحاملة للزوام بما في ذلك الحمض النووي، مرنا، لنكرنا، أو microRNAs.
