Dieses Protokoll stellt die Methode zur vorübergehenden Verbesserung der Herzfunktion in Duchennes Muskeldystrophie-Mäusen dar, indem Exon aus normalen myogenen Vorläuferzellen transplantiert wird. Die exosomale Transplantation kann die Herzfunktion bei DMD-Mäusen in Verbindung mit einer erhöhten Expression von Dystrophie in Empfängerherzen verbessern. Geeignete Methode zur Exonisolation, Reinigung und intramyokardialen Transplantation trägt zum Erfolg der Exontransplantation bei, um die Herzfunktion von Mäusen mit Duchennes Muskeldystrophie zu verbessern.
Die Von MPC abgeleitete Exosomentherapie könnte die Skelettmuskelfunktion durch exosomenvermittelten normalen Dystrophin mRNA-Transfer verbessern. Dieses Video zeigt die kritischen Techniken für die Exosomenreinigung, die intramyokardiale Exosomenabgabe und die Echokardiographie nach der Transplantation. Die Demonstration der Echokardiographie wird von Yan Shen, Techniker aus unserem Labor, durchgeführt.
Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie fünf Millionen C2C12-Zellen in eine 15-Zentimeter-Kulturschale mit 20 Millilitern vollständiger DMEM mit 10%FBS und Antibiotika. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um FBS bei 100, 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 18 Stunden zu ultrazentrieren, um exosome-depleted Medium vorzubereiten.
Entsorgen Sie das Pellet und sammeln Sie den Überstand. Wenn die Monolayer-Zellen 80% Konfluss in der Kulturschale erreichen, ersetzen Sie das komplette DMEM durch exosomen-erschöpftes Medium. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Überstand alle 48 Stunden aus der Zellkulturschale zu sammeln.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150 mal G für zehn Minuten, um die verbleibenden Zellen zu entfernen. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Zellablagerungen zu beseitigen und das gefilterte Medium auf ultraklare Rohre zu übertragen. Als nächstes verwenden Sie einen Schwenkschaufelrotor, um die Rohre bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten zu ultrazentrieren, um die Exosomen auszufällen.
Setzen Sie das exosomenhaltige Pellet in PBS wieder auf und füllen Sie dann das gesamte ultraklare Rohr mit PBS. Ultrazentrifugieren Sie diese Suspension bei 100, 00 mal G und bei 4 Grad Celsius für 120 Minuten, um kontaminierende Proteine zu beseitigen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Exosomepellet in 100 Mikroliter PBS wieder aus.
Bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung aufbewahren. Fixieren Sie zunächst jede anästhesierte Maus in der Rückenposition auf einer chirurgischen Plattform, indem Sie jede Gliedmaße mit Klebeband sichern. Legen Sie eine 3-0 Naht horizontal unter den oberen Zähnen, um den Oberkiefer an Ort und Stelle zu halten.
Als nächstes tragen Sie Enthaarungscreme auf die linke Seite der Brust der Maus auf, um die Tanne von der Haut zu entfernen. Führen Sie mit einem 24 Gauge-Katheter endotracheale Intubation über die Mundhöhle durch. Und verwenden Sie ein Nagetier-Beatmungsgerät, um die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzügen pro Minute zu belüften.
Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkohol und 10% Povidon Jod. Dann machen Sie einen 10 bis 15 Millimeter schrägen Schnitt von der linken Heckkante zur linken Achselhöhle. Verwenden Sie eine Schere, um die pectoralis major und pectoralis minor zu schneiden.
Und machen Sie eine linke Thoracotamy durch den vierten intercoastal Raum. Legen Sie vorsichtig Retraktorbänder ein, um die Brusthöhle auf eine Breite von 10 Millimetern zu verteilen, wobei darauf geachtet wird, die linke Lunge nicht zu beschädigen. Danach verwenden Sie zwei gerade Pinzette, um das Perikard zu entfernen.
Ziehen Sie sie auseinander und legen Sie sie hinter die Retraktor-Tipps, um das Herz zu entblößen. Verwenden Sie eine 31 Gauge Insulinnadel, um entweder MPC-Exo oder PBS intramyokardienweise in die vordere Wand des linken Ventrikels an einer Stelle zu injizieren. Verwenden Sie dann 6-0 Nylon Nähte, um die Brusthöhle, die Pectoralis Muskeln und die Haut, in der Reihenfolge zu schließen.
Zwei Tage nach der PBS-Exosomentransplantation die Mäuse wie im Textprotokoll beschrieben anästhesieren. Verwenden Sie Klebeband, um eine Maus in der Supine-Position zu fixieren und vorgeheiztes Akustikgel auf den linken Brustbereich aufzutragen. Verwenden Sie als Nächstes die Echokardiographie, um die linksventrikuläre Funktion zu bewerten.
Erhalten Sie die parasternale Langeachsenansicht des linken Ventrikels in zwei Dimensionen und drehen Sie dann die Ultraschallsonde um 90 Grad, um eine linke Ventrikel-Kurzachsenansicht auf papillarer Muskelebene zu erhalten. Danach nehmen Sie M-Mode-Echokardiographische Bilder auf und messen den linksventrikulären enddiastolischen Durchmesser, das linksventrikuläre endsystolische Volumen, das linksventrikuläre enddiastolische Volumen und das linksventrikuläre endsystolische Volumen. Die Herzfrequenz der Mäuse sollte für die Herzmessfunktion mindestens 400 bpm gesteuert werden.
Nachdem Exosomen isoliert und aus C2C12-Zellen gereinigt wurden, wird ihre Anwesenheit durch Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse bestätigt. Das Transmissionselektronenmikroskopiebild zeigt die Morphologie der hellen und runden förmigen Vesikel von C2C12-abgeleiteten Exosomen. Die Western-Blot-Analyse bestätigt das Vorhandensein von Exosomenmarkern wie CD63 und Tsg101.
Nach der intramyokardialen Injektion in die vordere Wand der linken Herzkammer von mdx-Mäusen wird ein transluzenter Ödembereich beobachtet, der darauf hinweist, dass die Injektion in das Myokard erfolgreich ist. Immunfluoreszierende Färbung für Dystrophin wird dann durchgeführt, um festzustellen, ob die kardiale MPC-Exo-Lieferung die Dystrophin-Protein-Expression in mdx-Herzen wiederherstellt. Teilweise Restauration der Dystrophin-Expression wird mit Membranlokalisierung in einigen Kardiomyozyten beobachtet.
Die Herzfunktion wird durch Echokardiographie zwei Tage nach der intramyokardialen Geburt gemessen, um festzustellen, ob die Transplation von MPC-Exo die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die MPC-Exo-Behandlung wird gesehen, um die Innere Wandbewegung im Vergleich zu PBS zu verbessern, was darauf hindeutet, dass die MPC-Exo-Transplantation die Herzfunktion bei mdx-Mäusen verbessert. Die Verwendung einer 31 Gauge Insulinnadel mit der Spitze bei etwa 20 Grad ist entscheidend für den Erfolg für die Lieferung der meisten Exosomen in das Myokard und maximiert die Exposition der injizierten Exosomen, um Kardiomyozyten zu beherbergen.
Im Anschluss an das Verfahren kann die Dystrophinexpression nach der Von MPC abgeleiteten Exosomeninjektion durch immunfluoreszierende Färbung nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die kardiale, von MPC abgeleitete Exosomenabgabe die Dystrophin-Protein-Expression wiederherstellt. Diese Technik wird den Weg für die Kardiomyopathie-Behandlung mit exosomentragenden therapeutischen Materialien wie DNA, mRNA, lncRNA oder microRNAs ebnen.
