Este protocolo presenta el método para mejorar transitoriamente la función cardíaca en los ratones con distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exón derivado de células progenitoras miogénicas normales. El trasplante exosomal puede mejorar la función cardíaca en ratones con DMD en asociación con una mayor expresión de distrofia en los corazones receptores. El método adecuado para el aislamiento de exones, la purificación y el trasplante intramiocardio contribuyen al éxito del trasplante de exón para mejorar la función cardíaca de los ratones con la distrofia muscular de Duchenne.
La terapia de exosomas derivada de MPC podría mejorar la función del músculo esquelético mediante la transferencia de ARNm de distrofina normal mediada por exosomas. Este video demuestra las técnicas críticas para la purificación de exosomas, la administración de exosomas intramiocardiales y la ecocardiografía después del trasplante. La demostración de ecocardiografía será realizada por Yan Shen, técnico de nuestro laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, sembrar cinco millones de células C2C12 en un plato de cultivo de 15 centímetros con 20 mililitros de DMEM completo que contiene 10%FBS y antibióticos. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífuir FBS a 100.000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 18 horas para preparar el medio agotado por exosomas.
Deseche el pellet y recoja el sobrenadante. Cuando las células monocapa alcancen el 80% de confluencia en el plato de cultivo, reemplace el DMEM completo por un medio agotado por exosomas. Utilice una pipeta de transferencia para recoger el sobrenadante del plato de cultivo celular cada 48 horas.
Centrifugar los tubos a 150 veces G durante diez minutos para extraer las células restantes. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar cualquier residero celular y transferir el medio filtrado a tubos ultra claros. A continuación, utilice un rotor de cubo oscilante para ultracentrífater los tubos a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para precipitar los exosomas.
Resuspender el pellet que contiene exosoma en PBS y luego llenar todo el tubo ultra-claro con PBS. Ultracentrífaza esta suspensión a 100, 00 veces G y a 4 grados Celsius durante 120 minutos para eliminar las proteínas contaminantes. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet exosoma en 100 microlitros de PBS.
Conservar a menos 80 grados Centígrados para uso futuro. Primero, fije cada ratón anestesiado en la posición supina en una plataforma quirúrgica asegurando cada extremidad con cinta adhesiva. Coloque una sutura 3-0 horizontalmente debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en su lugar.
A continuación, aplica crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho del ratón para quitar el abeto de la piel. Usando un catéter de calibre 24, realice la intubación endotraqueal a través de la cavidad oral. Y utilice un respirador de roedores para ventilar el ratón con aire de la habitación a una velocidad de 195 respiraciones por minuto.
Desinfectar la piel con 70%alcohol y 10%yodo povidona. Luego haz una incisión oblicua de 10 a 15 milímetros desde el borde esternal izquierdo hasta la axila izquierda. Use tijeras para cortar el pectoral mayor y pectoralis menor.
Y hacer una toracota izquierda a través del cuarto espacio intercostero. Inserte suavemente las bandas retráctiles para extender la cavidad torácica a una anchura de 10 milímetros teniendo cuidado de no dañar el pulmón izquierdo. Después de esto, use dos pinzas rectas para eliminar el pericardio.
Tire de ellos y colóquelos detrás de las puntas del retractor para exponer el corazón. Utilice una aguja de insulina de calibre 31 para inyectar MPC-Exo o PBS intramiocardimente en la pared anterior del ventrículo izquierdo en un sitio. Luego, usa suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, los músculos pectorales y la piel, en secuencia.
Dos días después del trasplante de exosomas de PBS, anestesia a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Utilice cinta adhesiva para fijar un ratón en posición supina y aplique gel acústico precalentado en la zona izquierda del pecho. A continuación, utilice la ecocardiografía para evaluar la función ventricular izquierda.
Obtener la vista de eje largo parasternal del ventrículo izquierdo en dos dimensiones y luego girar la sonda de ultrasonido 90 grados para obtener una vista del eje corto del ventrículo izquierdo a nivel muscular papilar. Después de esto, grabe imágenes ecocardiográficas en modo M y mida el diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo, el volumen sistólico final ventricular izquierdo, el volumen diastólico final del ventrículo izquierdo y el volumen sistólico final del ventrículo izquierdo. La frecuencia cardíaca de los ratones debe controlarse al menos 400 lpm para la función de medición cardíaca.
Después de que los exosomas se aíslen y se purifican a partir de células C2C12, su presencia se confirma mediante el análisis de microscopía electrónica de transmisión. La imagen de microscopía electrónica de transmisión muestra la morfología de las vesículas brillantes y redondas de los exosomas derivados de C2C12. El análisis de manchas occidentales confirma la presencia de marcadores de exosomas, incluidos CD63 y Tsg101.
Se observa un área de edema translúcido después de la inyección intramiocardio en la pared anterior del ventrículo izquierdo de ratones mdx que indica que la inyección en el miocardio es exitosa. La tinción inmunofluorescente para la distrofina se realiza entonces para determinar si la entrega MPC-Exo cardíaca restaura la expresión de distrofina-proteína en corazones mdx. La restauración parcial de la expresión de distrofina se observa con la localización de la membrana en algunos de los cardiomiocitos.
La función cardíaca se mide mediante ecocardiografía dos días después del parto intramiocardio para determinar si la translación de MPC-Exo mejora la función cardíaca en ratones mdx. El tratamiento MPC-Exo se ve para mejorar el movimiento de la pared interior en comparación con PBS, lo que sugiere que el trasplante MPC-Exo mejoró la función cardíaca en ratones mdx. El uso de una aguja de insulina de calibre 31 con la punta a unos 20 grados es fundamental para el éxito para la entrega de la mayoría de los exosomas en el miocardio y maximiza la exposición de exosomas inyectados para albergar cardiomiocitos.
Después del procedimiento, la expresión de distrofina se puede detectar después de la inyección de exosoma derivada de MPC por tinción inmunofluorescente que indica que la administración de exosomas derivada de MPC cardíaco restaura la expresión de la proteína distrfina. Esta técnica allanará el camino para el tratamiento de la cardiomiopatía con materiales genéticos terapéuticos portadores de exosomas, incluyendo ADN, ARNm, lncRNA o microRNAs.
