بالنسبة لأمراض حديثي الولادة مثل اعتلال عضلة القلب، فإن العلاج التجديدي باستخدام الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة له إمكانات هائلة. ومع ذلك، في المختبر تسارع نمو الخلايا يؤدي إلى تلف الحمض النووي من قبل الأيض المتراكمة مثل أنواع الأكسجين التفاعلي. زرع هذه الخلايا التالفة الحمض النووي من شأنه أن يؤدي إلى ضعف الغرة وتجديد العضو.
قبل الزرع، ينبغي تقييم نوعية الخلايا. هنا نقدم بروتوكولين خطوة بخطوة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا الجذعية. ومن خلال عرض الإجراءات، ستكون جيسيكا ميلر، الباحثة، ونيخيل ماردهيكار، الباحث، وفاشانثي راجاسيكران، وهو فني مختبر.
للبدء، ضع 500 ملليغرام من الأذانروز منخفض الذوبان في 100 ملليلتر من المياه الخالية من الحمض النووي الريبي النووي الريبي. سخني الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب الأاغروز. ثم ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى الحاجة.
لإعداد شرائح المذنب المغلفة مسبقًا ، ضع بضع قطرات من 0.5٪ agarose على شريحة زجاجية. انتشرت على الفور agarose لتشكيل طبقة رقيقة من طلاء agarose باستخدام غطاء. العمل في ظروف الإضاءة المنخفضة لتجنب تلف الخلايا الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وخلط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية و 90 ميكرولترات من محلول agarose في أنبوب.
ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمنع الأاغروز من التجمد. اخلط الحل دون إدخال فقاعات الهواء، والماصات 70 ميكرولترات لكل بقعة على شريحة المذنب المطلية مسبقًا. باستخدام طرف ماصة، انتشار خليط agarose الخلية لتشكيل طبقة رقيقة.
ضع الشريحة عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في وعاء ، غمر تماما الشريحة في عازلة التحلل البارد. ضع الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
استبدال العازلة تحلل مع محلول قلوي الباردة. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. بعد ترك الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى ، ضع الشريحة في خزان كهربائي أفقي.
املأ الخزان بمخزن كهرباء قلوي بارد حتى تغمر الشرائح تمامًا. تطبيق الجهد في فولت واحد لكل سنتيمتر لمدة 15 إلى 30 دقيقة. في وعاء، غمر تماما الشريحة في المياه الباردة ديونيد.
بعد دقيقتين، إزالة المياه ديونيد وإضافة المياه الأيونية العذبة، ثم كرر هذه الخطوة مرة ثانية. بعد ذلك، استبدل الماء الأيوني بالماء البارد بنسبة 70٪ الإيثانول. بعد خمس دقائق، قم بإزالة الشريحة بلطف دون إمالةها واتركها جافة.
مرة واحدة المجففة، إضافة 100 ميكرولترات من صبغة الحمض النووي المخفف إلى كل بقعة، وانتظر 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مرشح FITC في مجهر epifluorescence، التقاط صور من 50 إلى 100 المذنبات في المجموع لكل عينة. الخلايا القلبية المشتقة من iPS الموروثة كما هو موضح في بروتوكول النص.
لرؤية خلايا القلب المشتقة من iPS في شرائح الغرفة ، تخلص أولاً من وسيط الثقافة من الآبار ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين في البئر، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من اللوحة تحت المجهر فصاخل الخلية.
ثم إضافة ملليلتر واحد من CMM لوقف تريبسين. وضع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 200 مرة ز. تجاهل المتوسطة، وإضافة ملليلتر واحد من CMM، وإعادة ضغط الخلايا.
عد الخلايا وضبط عدد الخلايا للحصول على مليوني خلية في 1.6 ملليلتر من CMM. بذور الآن 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر من شريحة غرفة ثمانية بئر. اضغط على الشريحة بلطف لنشر الخلايا حول البئر.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. لعلاج دوكسيروبايسين المستمدة من iPS، تخلص من الوسيلة الثقافية من آبار القلب والوثنيين المشتقة من iPS، وغسل الخلايا بـ PBS. علاج الخلايا مع دوكسوروبيسين ميكرومولار واحد لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية.
التعرق المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. لأداء مناعي، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من الطازجة المعدة 4٪ شبهformaldehyde إلى كل بئر. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد في البئر، وكتلة لمدة 30 دقيقة في غرفة مرطب في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر وإضافة 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأساسي. بعد احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS.
إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
غسل مع المياه ديونيد قبل تركيب الشرائح مع antifade. ضع غطاء زجاجي، واخزن الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية. باستخدام المجهر confocal، واتخاذ ثلاث إلى خمس صور من الحقول العشوائية لكل عينة والمضي قدما في تحليل الصور.
لحساب استجابة الضرر DNA بؤرة، تحميل وتثبيت CellProfiler. حدد ملف واستيراد وخط أنابيب من الملف واختر ملف خط أنابيب يسمى puncti غاما H2AX. سحب وإسقاط المجلد الذي يحتوي على الصور المكتسبة من غاما-H2AX foci إلى إطار قائمة الملفات في قسم الصور وحدات الإدخال لتحليلها.
ثم اتبع الإرشادات كما هو موضح في بروتوكول النص. لتعيين معلمات الصور، اسحب الصورة المطلوبة للتحليل إلى قائمة الملفات. ضمن وحدات الإدخال، حدد الصور.
أيضاً في وحدات الإدخال، حدد بيانات التعريف، ثم حدد الأسماء والأنواع. بالنسبة للمجموعات، حدد لا. العمل في وحدات التحليل، حدد اللون إلى الرمادي.
ثم حدد السلس، حدد تحديد الكائنات الأساسية، ومرة أخرى حدد السلس. حدد التالي تحسين أو إيقاف الميزات، ثم حدد تحديد الكائنات الأساسية. لا يزال يعمل في وحدات التحليل، حدد ربط الكائنات، ثم تصنيف الكائنات، وأخيراً حدد التصدير إلى جدول البيانات.
انقر على تحليل الصور في اللوحة السفلية اليمنى لإجراء تحليل الصورة. وعند الانتهاء من التحليل بنجاح، يتم إنشاء عدة صور. لاحظ ملف CSV الذي تم إنشاؤه وحفظه في الموقع المناسب على الكمبيوتر.
يحتوي هذا الملف على البيانات الكمية لمزيد من التحليل. في جدول البيانات يسمى صورة تجربتي ، والعمود باء سيكون عدد النوى التي تصل إلى خمسة puncti ، والعمود دال سيكون عدد النوى التي لديها أكثر من خمسة puncti. إضافة الأعمدة B و D للحصول على العدد الإجمالي للنيات.
كرر هذه الخطوات لكافة الصور، وتغيير اسم ملف التجربة قبل كل تحليل. تظهر هنا صور ميكروجراف تمثيلية للمذنبات من خلايا iPS المعالجة بالدوكسو وغير المعالجة. تم العثور على كمية القاعدية من تلف الحمض النووي في خلايا iPS ، التي تم التعبير عنها كجزء صغير من تلف الحمض النووي ولحظة الذيل.
ومع ذلك، زاد علاج دوكسو من تلف الحمض النووي في خلايا iPS كما هو متوقع، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام مقايسة المذنب لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تظهر هنا ميكروجراف تمثيلية من مناعة غاما-H2AX، عند التكبير الأقل وفي التكبير الأعلى. في التحكم iPS المشتقة من cardiomyocytes، أكثر من 90٪ من الخلايا كان أقل من خمسة DDR foci لكل نواة.
وكان ما مجموعه أقل من 10٪ من الخلايا أكثر من ستة DDR foci لكل نواة. بالنسبة لـ iPS المستمدة من القلب وتربية لمدة ستة أشهر، كان أقل من 90٪ من الخلايا تصل إلى خمسة DDR foci لكل نويات، وما مجموعه أكثر من 13٪ من الخلايا كان أكثر من ستة DDR بؤر لكل نوى. في حين أن في doxo-iPS المستمدة من القلب، وأقل من 80٪ من الخلايا كان ما يصل إلى خمسة DDR foci لكل نواة.
وكان ما مجموعه حوالي 24٪ من الخلايا أكثر من ستة بؤر DDR لكل نوى. وتشير هذه البيانات إلى أن فترة طويلة من iPS المشتقة من القلب وزراعة الخلايا والعلاج doxo تسبب ضررا كبيرا الحمض النووي، مما يجعلها غير صالحة لزرع الخلايا. من المهم جدا تجنب المتغيرات أثناء خلط تعليق الخلية، لأن هذا قد يؤثر على الكهرباء.
بعد هذا الإجراء، يمكنك إجراء المقايسات المذنب وإجراءات مناعة مع الخلايا من أنواع مختلفة. وستتيح هذه التقنيات تقييم الخلايا من مختلف الأنواع لتلف الحمض النووي قبل استخدامها في دراسات زرع الخلايا.
