Bu protokol, duchenne'nin kas distrofisi farelerinde normal miyojenik progenitör hücrelerinden elde edilen ekson nakli ile kardiyak fonksiyonu geçici olarak iyileştirme yöntemini sunar. Ekzozomal transplantasyon, dmd farelerde kalp fonksiyonlarını iyileştirebilir ve alıcı kalplerde distrofi ekspresyonunun artması yla ilişkili olarak. Ekson izolasyon, saflaştırma ve intramiyokardiyal transplantasyon için uygun yöntem, Duchenne kas distrofisi olan fareleriçin kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için ekson transplantasyonunun başarısına katkıda bulunur.
MPC kaynaklı ekzozom tedavisi ekzozozom aracılı normal distrofin mRNA transferi ile iskelet kası fonksiyonlarını artırabilir. Bu video ekzozom arınma, intramiyokardiyal ekzozom doğum ve ekokardiyografi sonrası transplantasyon için kritik teknikleri göstermektedir. Ekokardiyografi gösterisi, laboratuarımızdan teknisyen Yan Shen tarafından yapılacak.
Bu prosedürü başlatmak için, tohum beş milyon C2C12 hücreleri 15 santimetre kültür çanak içine 20 mililitre tam DMEM içeren 10% FBS ve antibiyotik. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 100, 000 kez G ve dört derece Santigrat derece exozosome-tükenmiş orta hazırlamak için 18 saat boyunca FBS ultracentrifuge için bir sallanan kova rotor kullanın.
Pelet atın ve supernatant toplamak. Tek katmanlı hücreler kültür çanasında %80 birleştiğinde, tam DMEM'i ekzozom tükenmiş ortamla değiştirin. Her 48 saatte bir hücre kültürü çanağı süpernatant toplamak için bir transfer pipet kullanın.
Kalan hücreleri çıkarmak için 150 kez G tüpleri on dakika santrifüj. Herhangi bir hücre enkazını ortadan kaldırmak ve filtrelenmiş ortamı ultra net tüplere aktarmak için süpernatant'ı 0,22 mikrometre filtreden filtreleyin. Daha sonra, 100, 00 kez G ve 4 derece Santigrat 120 dakika ekzozomları çökeltmek için tüpler ultracentrifuge için bir salıncak kova rotor kullanın.
PBS'deki ekzozom içeren peleti yeniden askıya alın ve ultra berrak tüpün tamamını PBS ile doldurun. Ultracentrifuge bu süspansiyon 100, 00 kez G ve 4 derece santigrat 120 dakika kontamine proteinleri ortadan kaldırmak için. Supernatant atın ve PBS 100 mikrolitre ekzozom pelet resuspend.
İleride kullanılmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, her bir ekstremite bant ile güvence altına alarak cerrahi bir platform üzerinde supine pozisyonda her anestezili fare düzeltmek. Üst çeneyi yerinde tutmak için üst dişlerin altına yatay olarak 3-0 dikiş yerleştirin.
Daha sonra, köknarı deriden çıkarmak için farenin göğsünün sol tarafına tüy dökücü krem uygulayın. 24 gauge kateter kullanarak, oral kavite üzerinden endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Ve dakikada 195 nefes hızında oda havası ile fareyi havalandırmak için bir kemirgen vantilatör kullanın.
% 70 alkol ve% 10 povison iyot ile cildi dezenfekte. Sonra sol sternal kenarından sol koltuk altı için 10 ila 15 milimetre lik oblik kesi yapın. Pektoralis majör ve pektoralis minör kesmek için makas kullanın.
Ve dördüncü kıyılar arası uzayda sol torakotami yapın. Torasik boşluğu sol akciğere zarar vermemeye özen tayarak 10 milimetre genişliğe yaymak için retraktör bantlarını yavaşça takın. Bundan sonra, perikard kaldırmak için iki düz cımbız kullanın.
Onları ayırın ve kalbi ortaya çıkarmak için retractor ipuçları arkasına yerleştirin. MPC-Exo veya PBS intramiyokial inmiyokardial bir sitede sol ventrikül ön duvarına enjekte etmek için 31 gauge insülin iğnekullanın. Daha sonra, torasik boşluğu kapatmak için 6-0 naylon dikişler kullanın, pektoralis kasları, ve cilt, sırayla.
PBS ekzozom naklinden iki gün sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi fareleri anestezi edin. Bir fareyi supine pozisyonunda düzeltmek ve sol göğüs bölgesine önceden ısıtılmış akustik jel uygulamak için bant kullanın. Daha sonra, sol ventrikül fonksiyonunu değerlendirmek için ekokardiyografi kullanın.
İki boyutlu sol ventrikül parasternal uzun eksen görünümü elde ve sonra papiller kas düzeyinde bir sol ventrikül kısa eksen görünümü elde etmek için ultrason prob 90 derece döndürmek. Bundan sonra, M-modu ekokardiyografik görüntüleri kaydedin ve sol ventrikül son diyastolik çapı ölçmek, sol ventrikül end-sistolik hacim, sol ventrikül son diyastolik hacim, ve sol ventrikül sonu-sistolik hacmi. Farelerin kalp hızı kardiyak ölçüm fonksiyonu için en az 400 bpm kontrol edilmelidir.
Ekzozomlar C2C12 hücrelerinden izole edilip saflaştırıldıktan sonra iletim elektron mikroskobu analizi ile varlığı doğrulanır. İletim elektron mikroskobu görüntüsü C2C12 türetilmiş ekzozomların parlak ve yuvarlak şekilli veziküllerinin morfolojisini gösterir. Batı leke analizi CD63 ve Tsg101 dahil olmak üzere ekzozom belirteçlerinin varlığını doğrular.
Mdx farelerin sol ventrikülünün ön duvarına intramiyokardiyal enjeksiyon dan sonra yarı saydam ödem bölgesi gözlenir ve bu da miyokardiyuma enjeksiyonun başarılı olduğunu gösterir. Daha sonra distropofin için immünoresan boyama, kardiyak MPC-Exo doğumun mdx kalplerde distrofin-protein ekspresyonunu geri getirip getirmediğini belirlemek için yapılır. Kardiyomiyositlerin bazılarında membran lokalizasyonu ile distrofin ekspresyonunun kısmi restorasyonu gözlenmektedir.
MPC-Exo transplasyonunun mdx farelerde kardiyak fonksiyonu iyileştirip iyileştirmediğini belirlemek için intramiyokal doğumdan iki gün sonra ekokardiyografi ile kardiyak fonksiyon ölçülür. MPC-Exo tedavisinin PBS ile karşılaştırıldığında iç duvar hareketini geliştirdiği görülür ve bu da MdX farelerde MPC-Exo transplantasyonunun kardiyak fonksiyonu iyileştirdiğini düşündürmektedir. Yaklaşık 20 derece ucu ile 31 gauge insülin iğnesi kullanarak miyokardiyum içine en ekzozomların teslim ivedilikle başarı için önemlidir ve kardiyomiyosit barındırmak için enjekte ekzozomların maruz kalma maksimize eder.
İşlemden sonra, kardiyak MPC kaynaklı ekzozom doğumun distrofin-protein ekspresyonunu geri yükettiğini belirten immünofloresan boyama ile MPC türetilmiş ekzozom enjeksiyonundan sonra distrofin ekspresyonu saptanabilir. Bu teknik, DNA, mRNA, lncRNA veya mikroRNA'lar gibi ekzozom taşıyan terapötik genetik malzemelerle kardiyomiyopati tedavisinin önünü açacaktır.
