باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا بسهولة إنتاج عدد كبير من الفلافونول من فلافانونيس في وعاء واحد. هذه التقنية هي توفير العمالة والوقت، وفعالة للغاية من حيث التكلفة، وسهلة للسيطرة، لذلك لديها إمكانات التصنيع ضخمة. نعم، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في الإنتاج الاقتصادي من الأيض الثانوية الأخرى، لكنه يحتاج إلى بعض التعديلات عند تطبيقها عليه.
وقال انه عادة ما تحصل على أي شيء أو منخفضة جدا العائد. نصيحتي هي التعامل مع الإنزيمات المؤتلفة على الجليد وإضافة 10٪ الجلسرين إلى محلول الأسهم من الإنزيمات. وذلك لأنه فقط من خلال مظاهرة بصرية يمكن اليد الجديدة فهم التفاصيل الهامة والحقيقة التي تؤثر على التنفيذ الناجح للتجربة.
أولاً إعداد المخازن المؤقتة. جعل العازلة الاصطناعية مرتين عن طريق حل كمية مناسبة من TRIS-قاعدة، أسكوربات الصوديوم، حمض ألفا كيتوغلوتاريك في المياه دي المؤين، وماصة كمية مناسبة من الجلسرين إلى الحل. استخدام ماصة لإضافة حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة إلى 7.2، وضبط حجم بإضافة المياه دي المتأينة.
تخزين العازلة الاصطناعية مرتين في أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. ثم جعل حل الأسهم 100 مرات عن طريق حل كبريتات الحديد في المياه ديونيد. جعل حل الأسهم من 25 مليمولار الفلافونويد عن طريق حل الفلافونويد في الميثانول، وتخزين الحل في ناقص 20 درجة مئوية.
الخطوة الأكثر أهمية هي إنشاء نظام اصطناعي. لإنشاء نظام اصطناعي لإنتاج فلافانول من فلافانون ، قم أولاً بإعداد النظام الصناعي في أنبوب ملليلتر وفقًا للكاشيف المدرجة في هذا الجدول. ضع الأنبوب المفتوح في كتلة حرارة تهتز عند 40 درجة مئوية ، عند 600 دورة في الدقيقة لمدة أربعين دقيقة.
بعد ذلك، إنهاء التفاعل بإضافة 10 ميكرولترات من حمض الخليك، و 100 ميكرولترات من خلات الإيثيل. بعد ساعتين، استخدم ماصة لتعقّد المرحلة العضوية العليا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، ووضع الأنبوب في غطاء للتجفيف في درجة حرارة الغرفة. لأداء تحليل TLC ، أول استرداد الأنابيب من غطاء محرك السيارة ، وإعادة الذوبان مسحوق فلافانويد في 160 ميكرولترات من الميثانول في أنبوب.
إعداد عينات الفلافونويد أصيلة مع تركيزات تسلسلية، عن طريق تخفيف 25 ملولار محلول مخزون الفلافونويد في الميثانول. تحميل ميكرولتر واحد من عينة رد فعل redissolved، وميكر واحد من عينة الفلافونويد أصيلة، على لوحة بوليميد. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لتركيزات أخرى من الفلافونويد أصيلة على نفس لوحة.
ثم في غطاء الدخان، ووضع لوحة عينة محملة في اسطوانة الكروماتوغرافيا مليئة نظام المذيبات. إرفاق لوحة إلى الجزء السفلي من الاسطوانة، وتشغيل لوحة في نظام المذيبات لمدة 20 دقيقة. الهواء يجف الأطباق في درجة حرارة الغرفة.
مع زجاجة بخاخ، رش لوحات مع 1٪ حل إيثانول من كلوريد الألومنيوم، تليها تجفيف الهواء مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تصور البقع على لوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر، واتخاذ الصور، ثم على الكمبيوتر، وفتح برنامج ImageJ. انقر فوق الملف، فتح، لفتح الصورة ليتم تحليلها.
انقر فوق أداة التحديد المستطيلة على اليسار في واجهة مستخدم ImageJ. Outline في صورة العائد على الاستثمار مع الماوس ، واضغط على واحد لتسمية أول عائد الاستثمار. حرك التحديد المستطيل مع الماوس إلى عائد الاستثمار التالي، واضغط على اثنين لتسمية عائد الاستثمار الثاني.
كرر تسمية كافة ROIs الأخرى عن طريق الضغط على اثنين. اضغط على ثلاثة لإنشاء مخططات ملف تعريفي لجميع ROIs ، في نافذة منبثقة. ثم استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لإسقاط خطوط الأساس لتحديد منطقة مغلقة لكل ذروة اهتمام.
قم بتنشيط أداة العصا، عن طريق النقر على الرمز المقابل في واجهة مستخدم ImageJ. انقر داخل القمة لعرض نتائج جميع القمم في نافذة منبثقة. بعد ذلك ، في إكسيل ، رسم القيم الرمادية من النافذة المنبثقة ضد تركيزات الفلافونويد المقابلة ، لجعل منحنى معيار TLC أساسها من الفلافونويد أصيلة.
ثم حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول، وفقا للصيغة الناتجة. استخدام حقنة لمعالجة كل عينة بالتسلسل من خلال 0.45 ميكرومتر و 0.22 مرشحات ميكرومتر. قم بتحميل العينات في نظام HPLC-MS من خلال فوهة الشفط، ثم افصل العينات عند 30 درجة مئوية باستخدام عمود C18.
Elute العمود في ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة من قبل تدرج من 10 إلى 85 في المائة حجم نيتريل أسيتيل في الماء، ورصد امتصاص من eluate من 200 إلى 800 نانومتر. إجراء تحليل LC-MS في وضع أيون سالب، مع تدفق النيتروجين تجفيف 10 لترات في الدقيقة الواحدة في 300 درجة مئوية، في تدفق الغاز غدد من سبعة لترات في الدقيقة الواحدة في 250 درجة مئوية، وجمع البيانات باستخدام بنيت في البرامج. لاستخراج كروماتوغرافية أحادية الطول الموجي، افتح برنامج التحليل النوعي، وانقر فوق ملف، افتح ملف البيانات.
حدد الملف الذي سيتم تحليله في إطار ملف البيانات المفتوح، وانقر فوق فتح لفتح الملف. انقر بزر الماوس الأيمن في نافذة نتائج الكروماتوغرام ثم استخراج الكروماتوجرامات في القائمة المنبثقة. في قائمة الأنواع، انقر على الكروماتوجرامات الأخرى.
في مربع التحرير والسرد للكشف عن ، حدد DAD1 ، ثم انقر فوق موافق لعرض النتائج HPLC في إطار نتائج الكروماتوجرام. انقر فوق رمز التكامل اليدوي المرسو في أعلى نافذة نتائج الكروماتوغرام. رسم خط الأساس للذروة المطلوبة لتحليل التكامل اليدوي باستخدام الماوس.
انقر فوق عرض ، قائمة الذروة التكامل ، لعرض النتائج. نسخ نتائج مناطق الذروة إلى Excel، ومؤامرة منحنى HPLC القياسية القائمة على الفلافونويد أصيلة ضد تركيزات الفلافونويد المقابلة، ثم حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول وفقا للصيغة الناتجة. ثم كرر نفس الإجراءات لاستخراج الكروماتوجرامات أحادية الطول الموجي لتحليل بيانات التصلب المتعدد للكتلة الدقيقة لمركبات الفلافونويد.
انقر فوق رمز تحديد النطاق على شريط أدوات نتائج الكروماتوغرام. حدد ذروة الفائدة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في النطاق المحدد، وانقر على مستخلصات MS الطيف في القائمة المنبثقة لعرض النتائج في نافذة نتائج الطيف MS.
لتحديد ما إذا كان هذا النظام في المختبر يمكن استخدامها لتحويل فلافانون إلى فلافونول، تم إضافة NRN إلى النظام. وظهرت بقعتان جديدتان على لوحة من البولي أميد TLC. وأظهرت إحدى البقعة مسافة هجرة مماثلة للمسافة التي تفصل بين وزارة الصحة وتكفّل الأخرى بمسافة هجرة مماثلة لتلك التي كانت في منطقة KMF.
وقد أظهر تحليل آخر أجراه كل من HPLC وLC-MS أن المادة الكيميائية الجديدة أظهرت وقت احتفاظ بـ 12 دقيقة و20 دقيقة على التوالي، في ذروة أيونات شبه جزيئية M على Z عند 287 و285 والتي كانت مطابقة لتلك التي في DHK و KMF. ولتحديد ما إذا كان النظام يمكن استخدامه لتحويل الفلافونات الأخرى إلى فلافونولاتها المقابلة، تمت إضافة ERD إلى النظام. اثنين من البقع الجديدة على لوحة TLC بوليميد عرض مسافة الهجرة مماثلة لتلك التي من DHQ وQRC على التوالي.
وقد أظهرت تحليلات HPLC وLC-MS أن هذه المواد الكيميائية الجديدة كشفت عن وقت احتفاظ قدره 10 دقائق و16 دقيقة على التوالي، وذرية شبه جزيئية أيون M على Z في 303 و301، والتي تتوافق تماما مع تلك DHQ وQRC. عند إعداد النظام الاصطناعية، يجب إضافة إنزيم أخيرا، وإضافة كبريتات الحديد الثاني إلى الماضي. نعم، فإنه يوفر دليلا للإنتاج الاقتصادي من المستقلبات الثانوية الأخرى.
