通过建立单罐双酶级联,从弗拉瓦内生物合成一种黄酮

使用该协议，我们可以轻松地在一个锅中从黄酮中产生大量的黄酮。这种技术省时、省、省、地高、易于控制，具有巨大的产业化潜力。是的，此方法可以提供其他二级代谢物的经济生产见解，但应用到它时需要一些修改。

他通常一无所获或产量很低。我的建议是处理冰上重组酶，并在酶的库存溶液中加入10%甘油。这是因为只有通过视觉演示，新手才能了解影响实验成功实施的重要细节和真相。

首先准备缓冲区。通过将适当量的TRIS基、抗坏血酸钠、α酮糖酸溶解到去离子水中，将适当量的甘油移液器溶解到溶液中，使合成缓冲液得到两倍。使用移液器添加盐酸将 pH 调节到 7.2，并通过添加去离子水来调节体积。

将两次合成缓冲液存放在摄氏四度，供将来使用。然后在去硫化水中溶解硫酸铁六合液，使库存溶液得到100倍。在甲醇中溶解黄酮类化合物，使25毫摩尔黄酮的库存溶液，并在零下20摄氏度储存溶液。

最关键的一步是建立一个合成系统。要建立一个合成系统，以生产黄酮中的黄酮，首先根据本表中列出的试剂在两毫升管中准备合成系统。将打开的管子在 40 摄氏度的摇晃热块中，在 600 rpm 下放置 40 分钟。

之后，加入10微升醋酸和100微升乙酸乙酸乙酯，终止反应。两小时后，使用移液器将顶部有机相转至1.5毫升管，并在室温下将管放在烟罩中进行空气干燥。要执行TLC分析，首先从烟罩中取回管子，并在管中重新溶解160微升甲醇中的黄酮粉。

通过稀释甲醇中的25毫摩尔类黄酮库存溶液，准备具有序列浓度的正宗黄酮样品。将重新溶解反应样品的一微升和正宗黄酮样品的一微升加载到聚酰胺板上。对同一板上其他浓度的正宗黄酮进行同样的测量。

然后在烟气罩中，将样品加载板放入充满溶剂系统的色谱瓶中。将板连接到气缸底部，并在溶剂系统中运行板 20 分钟。空气干燥板在室温下。

使用喷雾瓶，用1%乙醇溶液氯化铝喷洒板，然后再次在室温下空气干燥30分钟。在 254 纳米的紫外光下可视化板上的斑点，然后拍摄图像，然后在计算机上打开软件 ImageJ。单击文件，打开，打开要分析的图像。

单击 ImageJ 用户界面中最矩形的选择工具。用鼠标勾勒出图像中的 ROI，然后按一个鼠标标记第一个 ROI。将鼠标右侧的矩形选择移到下一个 ROI，然后按两个键标记第二个 ROI。

重复重复按 2 来标记所有其他 RBI。按三个在弹出窗口中为所有 RBI 生成配置文件图。然后，使用直线选择工具放置基线，以便为每个感兴趣的峰值定义一个封闭区域。

通过单击 ImageJ 用户界面中的相应图标来激活魔杖工具。单击峰值内可显示弹出窗口中所有峰值的结果。接下来，在Excel中，根据相应的黄酮类化合物浓度绘制弹出窗口中的灰色值，以绘制真实黄酮的基于TLC的标准曲线。

然后根据生成的公式计算本协议中产生的类黄酮的收益率。使用注射器通过 0.45 微米和 0.22 微米过滤器按顺序处理每个样品。通过吸油喷嘴将样品加载到 HPLC-MS 系统中，并使用 C18 柱在 30 摄氏度下分离样品。

以每分钟一毫升的梯度将柱水，以10至85体积的乙酰硝酸在水中，并监测200至800纳米的亚硝酸盐的吸光。在负离子模式下执行 LC-MS 分析，在 300 摄氏度下以每分钟 10 升的干燥氮流量，在 250 摄氏度下以每分钟 7 升的护套气体流进行干燥氮流量，并使用内置软件收集数据。要提取单波长色谱仪，请打开定性分析程序，然后单击文件，打开数据文件。

选择要在打开的数据文件窗口中分析的文件，然后单击"打开"以打开文件。右键单击色谱图结果窗口中的鼠标，然后在弹出式菜单中提取色谱图。在类型列表中，单击其他色谱图。

在探测器组合框中，选择 DAD1，然后单击"确定"以在色谱图结果窗口中显示 HPLC 结果。单击停靠在色谱图结果窗口顶部的手动集成图标。为鼠标手动集成分析所需的峰值绘制基线。

单击视图，集成峰值列表，以显示结果。将峰值区域的结果复制到 Excel，根据相应的黄酮类化合物浓度绘制基于 HPLC 的正宗黄酮标准曲线，然后根据生成的公式计算本协议中产生的类黄酮的收益率。然后重复相同的过程，提取单波长色谱图，以分析MS数据，以准确质量的黄酮类化合物。

单击色谱图结果工具栏上的范围选择图标。选择兴趣的峰值。右键单击选定范围内的鼠标，然后单击弹出式菜单中的提取 MS 频谱，以在 MS 频谱结果窗口中显示结果。

为了确定此体外系统是否可用于将黄酮转换为黄酮，将 NRN 添加到系统中。聚酰胺TLC板上出现了两个新点。一个点显示迁移距离与DHK相似，其他地点与KMF相似。

HPLC 和 LC-MS 的进一步分析表明，新化学品在 Z 的准分子离子峰值 M 中分别表现出 12 分钟和 20 分钟的保留时间，与 DHK 和 KMF 相同。为了确定系统是否可用于将其他黄酮转化为相应的黄酮，ERD 被添加到系统中。聚酰胺TLC板上的两个新点分别显示了与DHQ和QRC相似的迁移距离。

HPLC 和 LC-MS 分析表明，这些新化学品的保留时间分别为 10 分钟和 16 分钟，在 Z 上具有 303 和 301 的准分子离子峰值 M，与 DHQ 和 QRC 的保留时间完全一样。在准备合成系统时，应最后添加酶，并添加硫酸铁第二至最后。是的，它为其他二级代谢物的经济生产提供了指南。