이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쉽게 한 냄비에 플라바놀에서 플라보놀의 꽤 많은 을 생산할 수 있습니다. 이 기술은 인건비와 시간 절약, 매우 비용 효율적이며 제어하기 쉽기 때문에 거대한 산업화 잠재력을 가지고 있습니다. 예,이 방법은 다른 보조 대사 산물의 경제 생산에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 적용 할 때 약간의 수정이 필요합니다.
그는 일반적으로 아무것도 또는 매우 낮은 수율을 얻을 것이다. 내 조언은 얼음에 재조합 효소를 처리하고 효소의 재고 용액에 10 %의 글리세린을 추가하는 것입니다. 시각적 데모를 통해서만 새로운 손이 실험의 성공적인 실행에 영향을 미치는 중요한 세부 사항과 진실을 이해할 수 있기 때문입니다.
먼저 버퍼를 준비합니다. 적량의 TRIS 베이스, 아스코르바트 나트륨, 알파 케토글루타릭 산을 이온화 된 물로 용액에 적절한 양의 글리세롤을 용액에 용해시킴으로써 두 번 합성 버퍼를 만듭니다. 파이펫을 사용하여 염산을 추가하여 pH를 7.2로 조정하고, 이온화 된 물을 추가하여 부피를 조정합니다.
향후 사용을 위해 두 번의 합성 버퍼를 섭씨 4도에 저장합니다. 그런 다음 탈온화 된 물에 철 황산염 heptahydrate를 용해하여 100 배 의 재고 솔루션을 만듭니다. 메탄올에 플라보노이드를 용해시켜 25 밀리머 플라보노이드의 스톡 솔루션을 만들고, 영하 20도의 용액을 저장합니다.
가장 중요한 단계는 합성 시스템을 설정하는 것입니다. 플라바놀에서 플라바놀을 생산하기 위해 합성 시스템을 설정하려면 먼저이 표에 나열된 시약에 따라 2 밀리리터 튜브에서 합성 시스템을 준비하십시오. 오픈 튜브를 섭씨 40도에서 600rpm에 400rpm에 흔들어 놓습니다.
그 후, 아세트산의 10 마이크로리터와 에틸 아세테이트 100 마이크로리터를 추가하여 반응을 종료한다. 2시간 후 파이펫을 사용하여 상단 유기상을 1.5밀리리터 튜브로 트랜퍼링하고 튜브를 후드에 배치하여 실온에서 공기 건조를 합니다. TLC 분석을 수행하기 위해 먼저 후드에서 튜브를 회수하고 튜브에서 메탄올 160 마이크로 리터에서 플라바노이드 분말을 재해석하십시오.
메탄올에 25 밀리머 플라보노이드 스톡 솔루션을 희석하여 본격적인 플라보노이드 샘플을 시리얼 농도로 준비합니다. 재용된 반응 샘플의 마이크로리터 1개, 정통 플라보노이드 샘플의 마이크로리터 1개를 폴리아미드 플레이트에 적재합니다. 같은 접시에 정통 플라보노이드의 다른 농도에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
그런 다음 연기 후드에 용매 시스템으로 채워진 크로마토그래피 실린더에 샘플로드 플레이트를 넣습니다. 플레이트를 실린더 바닥에 부착하고 용매 시스템에서 플레이트를 20분 동안 실행합니다. 공기는 실온에서 접시를 건조.
분무기 병으로 알루미늄 염화물의 1 % 에탄올릭 용액으로 접시를 분사한 다음 실온에서 30 분 동안 다시 공기 건조를합니다. 254 나노미터에서 UV 빛 아래 플레이트의 반점을 시각화하고 이미지를 촬영한 다음 컴퓨터에서 소프트웨어를 ImageJ로 엽니다. 파일을 클릭하여 열고 분석할 이미지를 엽니다.
ImageJ 사용자 인터페이스에서 왼쪽 대부분의 직사각형 선택 도구를 클릭합니다. 이미지의 ROI를 마우스로 윤곽을 지정하고 첫 번째 ROI에 레이블을 지정합니다. 마우스오른쪽마우스로 직사각형 선택을 다음 ROI로 이동하고 두 번째 ROI에 레이블을 지정하려면 두 개를 누릅니다.
두 개를 눌러 다른 모든 ROI에 레이블을 반복합니다. 팝업 창에서 모든 ROI에 대한 프로필 플롯을 생성하려면 세 가지를 누릅니다. 그런 다음 직선 선택 도구를 사용하여 각 관심 피크에 대해 닫힌 영역을 정의하도록 기준선을 삭제합니다.
ImageJ 사용자 인터페이스에서 해당 아이콘을 클릭하여 지팡이 도구를 활성화합니다. 피크 내부를 클릭하여 팝업 창의 모든 피크에 대한 결과를 표시합니다. 다음으로, Excel에서 팝업 창에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 회색 값을 플롯하여 본격적인 플라보노이드의 TLC 기반 표준 곡선을 만듭니다.
그런 다음 결과 수식에 따라 이 프로토콜에서 생산되는 관심의 플라보노이드의 수율을 계산합니다. 주사기를 사용하여 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 필터를 통해 각 샘플을 순차적으로 처리합니다. 흡입 노즐을 통해 샘플을 HPLC-MS 시스템에 로드하고 C18 열을 사용하여 샘플을 섭씨 30도에서 분리합니다.
물에서 10~85%의 아세틸 니트릴의 그라데이션으로 분당 1밀리리터로 컬럼을 엘테우트하고, 200~800나노미터의 용액의 흡수도를 모니터링한다. LC-MS 분석을 음의 이온 모드에서 수행하여 분당 10리터의 건조 질소 흐름이 섭씨 300도에서 250°C에서 분당 7리터의 시스 가스 흐름으로, 내장된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다. 단일 파장 크로마토그래프를 추출하려면 질적 분석 프로그램을 열고 파일을 클릭하여 데이터 파일을 엽니다.
열린 데이터 파일 창에서 분석할 파일을 선택하고 파일을 열어 보려면 열어 보도록 클릭합니다. 크로마토그램 결과 창에서 마우스를 마우스로 클릭한 다음 팝업 메뉴에서 크로마토그램을 추출합니다. 유형 목록에서 다른 크로마토그램을 클릭합니다.
검출기 콤보 상자에서 DAD1을 선택한 다음 확인을 클릭하여 HPLC 결과를 크로마토그램 결과 창에 표시합니다. 크로마토그램 결과 창 상단에 도킹된 수동 통합 아이콘을 클릭합니다. 마우스와의 수동 통합 분석에 필요한 피크에 대한 기준선을 그립니다.
결과를 표시하려면 보기, 통합 피크 목록을 클릭합니다. 피크 영역의 결과를 Excel에 복사하고, 해당 플라보노이드 농도에 대한 정통 플라보노이드의 HPLC 기반 표준 곡선을 플롯한 다음, 결과 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심있는 플라보노이드의 수율을 계산한다. 그런 다음 동일한 절차를 반복하여 단일 파장 크로마토그램을 추출하여 플라보노이드 화합물의 정확한 질량에 대한 MS 데이터를 분석합니다.
크로마토그램 결과 도구 모음에서 범위 선택 아이콘을 클릭합니다. 관심의 절정을 선택합니다. 선택한 범위에서 마우스를 마우스오른쪽단추로 클릭하고 팝업 메뉴에서 추출 MS 스펙트럼을 클릭하여 MS 스펙트럼 결과 창에 결과를 표시합니다.
이 체외 시스템이 플라보놀로 플라바놀을 변환하는 데 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 NRN이 시스템에 추가되었습니다. 폴리아미드 TLC 플레이트에 두 개의 새로운 반점이 나타났습니다. 한 지점은 DHK와 유사한 마이그레이션 거리를 보였으며 다른 지점은 KMF와 비슷합니다.
HPLC와 LC-MS에 의한 추가 분석은 새로운 화학 물질이 DHK와 KMF와 동일했던 287 및 285에서 Z를 통해 준 분자 이온 피크 M에서 각각 12 분 및 20 분의 보존 시간을 보였다는 것을 보여주었습니다. 시스템이 다른 플라바놀을 해당 플라보놀로 변환하는 데 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 ERD가 시스템에 추가되었습니다. 폴리아미드 TLC 플레이트의 두 개의 새로운 스팟은 각각 DHQ 및 QRC와 유사한 이동 거리를 표시했습니다.
HPLC와 LC-MS 분석은 이 새로운 화학 물질이 각각 10 분 및 16 분의 보존 시간을 드러냈으며, 303 및 301에서 Z를 통해 준 분자 이온 피크 M이 정확히 DHQ 및 QRC에 해당한다는 것을 입증했습니다. 합성 시스템을 준비할 때, 마지막으로 효소를 추가하고, 마지막으로 두 번째로 철 황산염을 추가해야 합니다. 예, 그것은 다른 이차 대사 산물의 경제적 생산에 대한 가이드를 제공합니다.
