إن تحريض مشتقات السكّة من الخلايا الجذعية المستحثة المتعددة القدرات، أو iPSC، هو خطوة حاسمة لاستخدام الخلايا الجذعية المتعدّدة القدرات في العلاج التجديدي أو تطبيقات أبحاث الأمراض. ويمكن استخدام هذه التقنية لتمييز خلايا iPS البشرية إلى مشتقات السكومي مثل myotome، والأمراض الجلدية، والتصلب، وخلايا السينوديتوم في ظل ظروف محددة كيميائيا. باستخدام iPSC المنشأة من المريض الذي يعاني من اضطراب العضلات والعظام المستعصية، يمكن استخدام هذه الطريقة لنميث النمط الظاهري للمرض واختبار العلاجات المخدرات الجديدة.
ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لتعزيز فهمنا لعلم الأحياء والآليات الكامنة في تطوير mesoderm الباركسي أثناء تكوين الجنين البشري. قبل أربعة أيام من بدء التعريفي في منتصف منتصف الفترة قبل بدء العمل، اغطي طبقًا طوله 10 سنتيمترات مع أربعة ملليلترات من محلول المصفوفة خارج الخلية لاحتضان ليلي عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، استبدال حل مصفوفة خارج الخلية مع ثمانية ملليلتر من وحدة تغذية خالية من خلية ثقافة المتوسطة.
لبدء زراعة خالية من التغذية، وغسل ثقافة iPSC الإنسان مع برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر واحد من حل CTK إلى طبق الثقافة. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال عن قاع الطبق ، وغسل الثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لإزالة جميع الخلايا المغذية SNL تماما قبل إضافة ملليلتر واحد من خلية خالية من التغذية ثقافة المتوسطة إلى الطبق. استخدم مكشطة الخلايا لفصل الخلايا الجذعية يدويًا، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يبلغ 15 ملليلترًا.
بلطف ماصة حل الخلية ثلاث مرات مع 1، 000 ميكرولتر ماصات طرف، ونقل الخلايا إلى طبق الثقافة المغلفة مصفوفة خارج الخلية. ثم، قم بإرجاع الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاثة أيام. في نهاية الحضانة، استبدال متوسطة لثقافة الخلايا الخالية من التغذية بثمانية ملليلترات من وسيط تعريفي وسيط وسيط، والشروع في تمايز ميسوميرم ما قبل المحيط في حاضنة ثقافة الخلية للأيام الأربعة التالية، وتغيير الوسط في اليوم الثالث.
في نهاية الحضانة، عزل خلايا البروتين 1 الشبيهة بالدلتا عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة، وجمع الخلايا التي تم فرزها عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسط التعريفي المتوسط سوميتيك للفرز، والبذور مرة واحدة 10 مرات للخلايا الخامسة في كل بئر من مصفوفة خارج الخلية حل المغلفة 12-جيدا لوحة تحتوي على ملليلتر واحد من المتوسط التعريفي المتوسط memitic mesoderm تستكمل مع 10 ميكرومولر من كيناز رو، أو روك، المانع Y-27632. ثم، إعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة أربعة أيام أخرى، وتغيير المتوسطة لا تحتوي على المانع في الأيام الأولى وثلاثة من الثقافة.
لتمايز سيندتوم من خلايا sclerotome، وغسل خلايا sclerotome مع برنامج تلفزيوني قبل فصل الخلايا مع 0.2 ملليلتر من خلية كاشف تفكك في بئر. بعد ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 0.8 ملليلتر من المتوسط القاعدي المعرفة كيميائيا لكل بئر، وفصل الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من syndetome التعريفي المتوسطة واحد للعد.
البذور خمس مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في كل بئر من مصفوفة خارج الخلية حل المغلفة 24 جيدا لوحة تحتوي على ملليلتر واحد من syndetome التعريفي المتوسطة واحد، والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الثالث من التعريفي سينديتومي، استبدل الوسيط بوسيلة تحريض سيندتوم المتوسطة اثنين، واعيد الطبق إلى الحاضنة لمدة 18 يومًا، وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد التمايز الميزومي، أكثر من 85٪ من الخلايا إيجابية للبروتين الشبيه بالدلتا 1، علامة من ميسوديرم ما قبلية، ولكن سلبية لPAX3، علامة من الميزومرم سوميتيك.
يصبح هذا السكان PAX3 خلايا ميسوديرمة سوميتيك إيجابية بعد أربعة أيام من التعريفي الميديمي. وعلاوة على ذلك، تلطيخ من cadherin-11، علامة من الظهارية، يتراكم فقط في تقاطعات الخلية إلى الخلية، بعد إضافة CHIR99021. يمكن تقييم التمايز نحو dermomyotome، myotome، الجلد، sclerotome، وsydetome بواسطة الكيمياء المناعية وPAX3 fluorescence.
على غرار الخلايا الليفية الجلدية البشرية، تنتج الخلايا الجلدية المشتقة من iPSC الكولاجين وحمض الهيالوروني كما تم تقييمه من قبل ELISA. لإثبات التفاعل مقارنة من syndetome الإنسان المشتقة من iPSC وtenocytes الكبار الإنسان، يمكن إجراء مقايسة تحفيز التمدد الميكانيكية. قبل iPSC التمرير، تأكد من أن التقاء الثقافة بين 70 إلى 80٪ والخلايا المنقسمة بنسبة واحد إلى اثنين إلى واحد إلى أربعة وفقا لذلك.
هذا التمرير أمر بالغ الأهمية لتمايز iPSCs الناجحة. بالنسبة للعلاجات المستقبلية القائمة على الخلايا باستخدام هذه الطريقة ، من الضروري إنشاء حالة جديدة خالية من الجراثيم لا تتضمن أي مكونات مشتقة من الحيوانات غير البشرية.
