人工多能性幹細胞(iPSC)からのスマイト誘導体の誘導は、再生療法や疾患研究用途に多能性幹細胞を使用するための重要なステップである。この技術は、ヒトiPS細胞を、化学的に定義された条件下でミオトーム、皮膚、硬化物、シンデトーム細胞などのスマイト誘導体に分化するために使用することができる。難治性筋骨格系障害に罹患した患者から確立されたiPSCを用いて、この方法は、疾患の表現型をモデル化し、新しい薬物療法をテストするために使用することができる。
この方法は、ヒト胚発生時のパラクジアル中胚膜の発達の基礎となる生物学とメカニズムの理解を深めるためにも適用できる。前ミツミリック中皮誘導を開始する4日前に、10センチメートルの皿に4ミリリットルの細胞外マトリックス溶液をコーティングし、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、フィーダーフリー細胞培養培地の8ミリリットルで細胞外マトリックス溶液を交換する。
フィーダーフリー培養を開始するには、ヒトiPSC培養液をPBSで洗浄し、1ミリリットルのCTK溶液を培養皿に加えます。細胞が皿の底から外れ始めると、新鮮なPBSで培養を2回洗浄し、すべてのSNLフィーダー細胞を完全に除去してから、フィーダーフリー細胞培養培地を1ミリリットル添加します。細胞スクレーパーを使用して幹細胞を手動で取り外し、細胞を15ミリリットルの円錐チューブに移します。
1,000マイクロリットルピペットチップで細胞溶液を3回軽くピペットし、細胞外マトリックスコーティング培養皿に細胞を移す。次いで、細胞を細胞培養インキュベーターに3日間戻す。インキュベーション終了時に、フィーダーフリー細胞培養培地を8ミリリットルの前ミチミク中皮誘導培地に置き換え、次の4日間、細胞培養インキュベーターで前から中皮分化を開始し、3日目に培地を変更する。
インキュベーションの終了時に、デルタ様タンパク質1陽性細胞をフローサイトメトリーで単離し、遠心分離により選別した細胞を収集する。ペレットをカウント用の中血症誘導培地1ミリリットルで再懸濁し、10ミリリットルのスマイト中皮誘導培地を含む細胞外マトリックス溶液コーティング12ウェルプレートの各ウェルに10回10〜5番目の細胞を播種し、10ミクロモルのrhoasase、またはROCK阻害剤、Y-27632を添加した。次いで、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに4日間戻し、培養の1日目および3日目に阻害剤を含まない培地を変更する。
硬化細胞からのシンデトーム分化については、PBSで硬化細胞を洗浄してから、ウェルあたり0.2ミリリットルの細胞解離試薬で細胞を取り外します。室温で3分後、各ウェルに化学的に定義された基底媒体の0.8ミリリットルを加え、細胞スクレーパーで細胞を取り外します。遠心分離のために細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、1ミリリットルのシンデトーム誘導培地1でペレットを再懸濁してカウントする。
1ミリリットルのシンデトーム誘導培地1を含む細胞外マトリックス溶液被覆24ウェルプレートの各ウェルに50〜4番目の細胞をシードし、3日間そのプレートを細胞培養インキュベーターに戻す。シンデトーム誘導の3日目に、培地をシンデトーム誘導培地2に交換し、プレートを18日間インキュベーターに戻し、3日ごとに培地を交換する。前ミテミック中皮分化後、細胞の85%以上がデルタ様タンパク質1に対して陽性であり、前ミツミクス中皮のマーカーであるが、P3は陰性である、無煙中皮のマーカーである。
この集団は、4日間の中等中皮誘導後にPAX3陽性の中中皮細胞となる。また、カドヘリン-11の染色は、上皮化中血中半球のマーカーであり、CHIR99021の添加に続いて細胞間接合部に蓄積するのみである。皮膚細胞、ミオトーム、皮膚、硬化物、およびシンデトームに対する分化は、免疫細胞化学およびPAX3蛍光によって評価することができる。
ヒト皮膚線維芽細胞と同様に、iPSC由来の皮膚細胞は、ELISAによって評価されるようにコラーゲンおよびヒアルロン酸を産生する。ヒトiPSC由来シンデトームとヒト成体テノサイトの同等の反応性を実証するために、機械的ストレッチ刺激アッセイを行うことができる。iPSC合格前に、培養合流率が70~80%、それに応じて分割細胞が1対2~1対4の比率であることを確認します。
このパスを使用することは、iPSC の差別化を成功させるために重要です。この方法を用いた将来の細胞ベースの治療法では、ヒト以外の動物由来の成分を含まない新しい無菌状態を確立する必要がある。
