인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

유도된 만능 줄기 세포 또는 iPSC로부터 의 소미트 유도는 재생 치료 또는 질병 연구 응용을 위해 다능성 줄기 세포를 사용하기위한 중요한 단계입니다. 이 기술은 화학적으로 정의된 조건하에서 심근, 피부막, 경화및 syndetome 세포와 같은 솜마이트 유도체로 인간 iPS 세포를 분화하는 데 사용될 수 있다. 난치성 근골격계 장애를 앓고 있는 환자로부터 확립된 iPSC를 사용하여, 이 방법은 질병의 표현형을 모델링하고 새로운 약물 치료를 시험하는 데 사용될 수 있다.

이 방법은 또한 인간 적인 배아 발생 도중 파라시 중소근의 발달의 근본적인 생물학 그리고 기계장치의 우리의 이해를 발전시키기 위하여 적용될 수 있습니다. 전소나이트 중추 유도를 시작하기 4일 전, 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠복할 수 있도록 세포외 매트릭스 용액 4밀리리터로 10센티미터 접시를 코팅합니다. 다음 날 아침, 세포외 매트릭스 용액을 피더 가 없는 세포 배양 배지의 8밀리리터로 대체한다.

피더가 없는 배양을 시작하려면 인간 iPSC 문화를 PBS로 세척하고 문화 요리에 CTK 솔루션 1밀리리터를 추가하십시오. 세포가 접시 바닥에서 분리되기 시작하면 신선한 PBS로 배양을 두 번 씻고 모든 SNL 피더 세포를 완전히 제거한 후 식에 피더가 없는 세포 배양 배지 1 밀리리터를 첨가하십시오. 세포 스크레이퍼를 사용하여 줄기 세포를 수동으로 분리하고 세포를 15 밀리리터 원추형 튜브로 이송합니다.

셀 용액을 1, 000 마이크로리터 파이펫 끝으로 세 번 부드럽게 피펫하고 세포를 세포 외 매트릭스 코팅 배양 접시로 옮길 수 있습니다. 이어서, 세포를 세포 배양 인큐베이터로 3일 동안 돌려보라고 한다. 인큐베이션의 끝에서, 피더 없는 세포 배양 배지를 소미티트 중수 유도 배지의 8밀리리터로 대체하고, 다음 4일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 조소메타성 중수 분화를 개시하여 3일째에 배지를 변경한다.

인큐베이션의 끝에서, 혈류 세포에 의해 델타와 같은 단백질 1 양성 세포를 분리하고 원심분리에 의해 정렬된 세포를 수집한다. 계산을 위한 소미티드 중소포 유도 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재중단하고, 1회 10회 종자 10번의 다섯 번째 세포에 세포외 매트릭스 용액 코팅 12웰 플레이트는 로키나제10 마이크로몰라로 보충된 소미티드 메소데름 유도 배지의 1밀리리터를 함유하고 있다. 이어서, 세포를 세포 배양인배양소로 4일 이상 반납하고, 배지를 변화시키는 것은 배양의 1일과 3일에 억제제가 함유되지 않는다.

경화 세포로부터의 신디토메 분화를 위해, 경화 세포매경화 시약의 0.2 밀리리터로 세포를 분리하기 전에 PBS로 경화세포를 세척한다. 실온에서 3분 후, 화학적으로 정의된 기저 배지 0.8 밀리리터를 각 우물에 추가하고 세포 스크레이퍼로 세포를 분리합니다. 원심분리를 위해 15밀리리터 원뿔관으로 세포를 옮기고, 계산을 위해 1밀리리터의 신디토메 유도 배지1밀리리터로 펠릿을 재보선한다.

종자 5회 10회 세포외 매트릭스 용액의 각 웰내로 1밀리리터를 함유하고, 3일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다. 3일째인 3일에는 배지를 신디사이저 유도 매체 2로 교체하고, 플레이트를 18일 동안 인큐베이터로 돌려보내 3일마다 배지를 변경한다. 전소성 중수 분화 후, 세포의 85% 이상이 델타와 같은 단백질 1, 예소성 중수의 마커이지만, 소미성 중수의 마커인 PAX3에 대해 음의가 있습니다.

이 인구는 소미티드 중구 유도의 4 일 후에 PAX3 양성 소성 중피 세포가 됩니다. 또한, 상피 소미티드 중소의 마커인 카데린-11의 염색은 CHIR99021의 첨가에 따라 세포 대 세포 접합부에만 축적된다. 데르모메, 근막, 피부막, 경화장 및 syndetome을 향한 분화는 면역 세포화학 및 PAX3 형광에 의해 평가될 수 있다.

인간 진피 섬유아세포와 유사하게, iPSC 유래 피부막 세포는 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 콜라겐과 히알루론산을 생성한다. 인간 iPSC 유래 신디사이저와 인간 성자 테노사이클의 비교 반응성을 입증하기 위해 기계적 스트레치 자극 분석이 수행될 수 있다. iPSC 패싱 전에 배양 결합이 70~80%이고 분할 세포가 1대 2대 4 비율로 속한다는 것을 확인한다.

이 패시징은 성공적인 iPSC 차별화에 매우 중요합니다. 이 방법을 사용하여 미래의 세포 기반 치료의 경우, 비 인간 동물에서 파생 된 성분을 포함하지 않는 새로운 세균없는 상태를 확립 할 필요가있다.