Super-القرار المجهر الإضاءة منظم، 3D-SIM، هو تقنية مبتكرة لتصور البروتينات مراسل الفلورسنت من مجموعات مستقبلات الإنبات في أغشية البوغ. باستخدام هذه الإجراءات، يمكن تحقيق قرار غير مسبوقة من التعريب الجرثومي و بوغ مجالات الدهون الغشاء الداخلي. وسيتم إثبات هذه التقنية من قبل طالب الدكتوراه خوان وين وطالب ماجستير العلوم ريمون بسمان من مختبرنا.
قبل البدء في الإجراء، تنظيف الأغطية عالية الدقة مع حمض الهيدروكلوريك واحد المولر لمدة 30 دقيقة في حمام مائي يهز بلطف، تليها اثنين، خمس دقائق يغسل في الماء من النوع 1 فائقة الخطورة. بعد الغسيل الثاني، ضع الغطاءات في 100٪ الإيثانول لمدة ثلاث دقائق قبل تجفيف الأغطية والتحقق من وضوحها. ثم، الشرائح مجهر الزجاج نظيفة مع 70٪ الإيثانول لمدة دقيقة واحدة قبل السماح للشرائح لتجف والتحقق من وضوحها.
بالنسبة للميكروسفير الفلورسنت وتصوير البوغ ، أول شريحة قبل الدافئة على كتلة تسخين 70 درجة مئوية لبضع ثوان قبل إضافة 70 درجة مئوية ، 65 ميكرولتر قطرات من تعقيم 2 ٪ agarose على واحدة من الشرائح. ضع الشريحة الأخرى في الأعلى لنشر الأغاروز بين الشرائح. بعد خمس دقائق، قم بإزالة إحدى الشرائح وقطع الأغاروز المجفف إلى قسم واحد تلو الآخر.
إضافة مرة واحدة 10 إلى الميكروسفيرات الفلورية الثامنة أو الجراثيم في 0.4 ميكرولترات من الماء العقيمة، فائقة الpure النوع 1 إلى agarose، ووضع غطاء عالية الدقة على التصحيح باستخدام غطاء لشريحة الشريحة من الشريحة على سطح الغطاء. ثم، إصلاح 65 ميكرولتر، 1.5-في-1.6 سنتيمتر جين الإطار على شريحة المجففة، ووضع غطاء على الإطار، وإغلاق جميع زوايا الإطار. لتصوير العينات، ضع الشريحة على مجهر إضاءة منظم مجهز بهدف زيتي 100X، وركز على 100 نانومتر فلوروستين فيض.
ضبط حلقة التصحيح على الهدف 100x حتى يتم الحصول على وظيفة انتشار نقطة متماثلة لتقليل عدم وضوح الصور، وتحديد حقل الرؤية مع ما يقرب من 10 جولة الفلورسنت microspheres. تطبيق تعديل التركيز صريف لأطوال موجية الإثارة المعينة، في هذه الحالة، 561 و 488 نانومتر، كدليل لبرامج تحليل الصور قبل التركيز على الجراثيم مع ضوء الإرسال. التقاط صورة ضوء الإرسال في وضع متوسط 16x مع التعرض 20 مللي ثانية لكل صورة.
ثم، التقاط 3D-هيكل المجهر الإضاءة الصور الفلورية الخام من الجراثيم مع وضع الإضاءة 3D-SIM. لإعادة بناء الشريحة، انقر فوق Param على ورقة علامة التبويب لوحة الإضاءة الهيكلية لفتح إطار إعادة بناء شريحة N-SIM. اتبع الإرشادات المقترحة، وانقر على عناصر التحكم المناسبة لتعيين تباين التضمين الإضاءة إلى السيارات، ومنع الضوضاء عالية الدقة إلى واحد، والخروج من طمس التركيز إلى 0.05 كنقاط انطلاق.
ثم انقر فوق إعادة بناء شريحة لإعادة بناء الصورة وتقييم جودة الصور المعاد بناؤها من خلال الصور السريعة التي تم تحويلها فورييه و نقاط إعادة الإعمار التي يتم عرضها بعد إعادة الإعمار. ضبط الضوضاء عالية الدقة من 0.1 إلى خمسة والخروج من منع طمس التركيز من 0.01 إلى 0.5 حتى يتم الحصول على أفضل إعدادات المعلمة. ثم انقر فوق تطبيق لتطبيق التغييرات.
انقر فوق إغلاق لإغلاق الإطار. فتح FM4-64 ملطخة PS4150 جراثيم صورة الخام. ثم انقر فوق إعادة بناء شريحة لتنفيذ إعادة إنشاء شريحة وحفظ الصورة المعاد بناؤها.
لتحويل الصور الخام 3D-SIM من geminosome KGB80 إلى صور الزائفة widefield، انقر يسارا على البرنامج المساعد ImageJ SIMcheck وحدد البيانات الخام SI وSeded. عشوائيا اختيار حوالي 25 جراثيم في كل صورة نقل مقلوب لتحليل germinosome في وقت لاحق في الصور الفلورسنت الزائفة واسعة حتى تم اختيار ما يقرب من 350 الجراثيم. ثم استخدم ImageJ لتقييم أقصى كثافة لكل إشارة فلورية تعبر عنها كل مجموعة من الجراثيم والكثافة المتكاملة لكل صورة 3D بوغ.
لتحليل الصور الزائفة واسعة النطاق من جهاز جرمينسوم KGB80، استخدم متوسط قيمة كثافة متكاملة من سبع اكدسات كما كثافة إشارة متكاملة من بوغ KGB80. ثم، تحديد كثافة الخلفية عن طريق تصوير سلالة خلفية PS4150 باستخدام إعدادات متطابقة، و تعتبر البقع الفلورية في جراثيم KGB80 الفردية مثل بؤر الجرثومية عندما تكون مميزة بوضوح عن الخلفية. في هذه التجربة التمثيلية، ظهرت بؤر اثنين من جراثيم الفلورية GerD-GFP في أكوام مختلفة مع ثلاثة بؤرة GFP-GerD-المجموع لوحظ في المكدس Z3 التركيبي.
هنا ، لوحظ بوغ مع نقطة اتصال واحدة فقط GerD-GFP في بوغ. في المجموع، كان حوالي 40 إلى 50٪ من الجراثيم اثنين أو واحد GerD-GFP وGerKB-mCherry العنقودية، على التوالي. في حين أن الكثافة المتكاملة لبروتين سقالة GerD-GFP كانت مختلفة بين مجموعات سكانية مختلفة، فإن الكثافة المتكاملة لـ GerKB-mCherry كانت نفسها تقريباً في مختلف السكان.
عندما كان بوغ بؤر متعددة، كانت أقصى كثافة الفلورنس من GerD-GFP وGerKB-mCherry بؤرية تميل إلى الانخفاض، والحد الأقصى للفلورس من جميع النقاط المضيئة، التي تعتبر بؤرة الجرثومية، كان أعلى من الحد الأقصى للفلوروس السيارات من الجراثيم PS4150. وتجدر الإشارة إلى أن أكثر إشراقا FM4-64 البقع مماثلة لsoci germinosome تظهر في كل من جراثيم PS4150 سليمة وفكها، مما يشير إلى أن هذه البقع FM4-64 أكثر إشراقا قد تشارك في تجميع البروتينات الجرثومية في الغشاء الداخلي. إضافة جراثيم إلى agarose ووضع agarose في الإطار يتطلب حركة السوائل المستمرة والدقيقة لهذه المواد المصغرة.
تحويل الصور الخام 3D-SIM من KGB80 germinosome إلى صور الزائفة widefield وتفسيرها يتطلب معرفة الخبراء في علم الأحياء سبور. يمكن تطبيق إجراء المجهر الإنارة المنظم لدينا على تصوير البروتينات المنخفضة وفيرة أو المراسلين الخافتين في البكتيريا المختلفة أو غيرها من المواد الفرقة. تنظيم رثة يمكن الآن أن تدرس باستخدام إجراءات وضع العلامات المزدوجة لتقييم التوطين المشترك للبروتينات عصيات وغشاء مجالات محددة.
