La microscopia ad illuminazione strutturata a super-risoluzione, 3D-SIM, è una tecnica innovativa per la visualizzazione delle proteine reporter fluorescenti dei cluster di recettori della germinazione nelle membrane spore. Utilizzando queste procedure, è possibile ottenere una risoluzione insuperabile della localizzazione germinosoma e dei domini lipidici della membrana interna delle spore. La tecnica sarà dimostrata dal dottorando Juan Wen e dallo studente di Master of Science Raymond Pasman del nostro laboratorio.
Prima di iniziare la procedura, pulire le coperture ad alta precisione con acido cloridrico un molare per 30 minuti in un bagno d'acqua che trema delicatamente, seguito da due lavaggi di cinque minuti in acqua ultrapura di tipo 1. Dopo il secondo lavaggio, posizionare i copricapo in etanolo al 100% per circa tre minuti prima di asciugare i copricapo e verificarne la chiarezza. Quindi, pulire i vetrini in vetro con 70%etanolo per un minuto prima di consentire alle diapositive di asciugarsi e verificarne la chiarezza.
Per l'imaging fluorescente di microsfere e spore, prima preriscaldare due diapositive su un blocco riscaldante Celsius di 70 gradi per alcuni secondi prima di aggiungere una goccia Celsius di 70 gradi Celsius, 65 microliter di agarosio sterilizzato al 2% su una delle diapositive. Posizionare l'altra diapositiva sopra per distribuire l'agarosio tra le diapositive. Dopo cinque minuti, rimuovere uno dei vetrini e tagliare l'agarosio essiccato in una sezione di uno per un centimetro.
Aggiungere una volta 10 alle ottava microsfere fluorescenti o spore in 0,4 microlitri di acqua sterile ultrapura di tipo 1 all'agarosio e posizionare un coverslip ad alta precisione sul cerotto utilizzando il coverslip per far scorrere il cerotto dello scivolo sulla superficie del copripacchi. Quindi, fissare un gene frame da 65 microliter, 1,5 per 1,6 centimetri su uno scivolo essiccato e posizionare il coprisciuga sul telaio, chiudendo tutti gli angoli del telaio. Per l'imaging dei campioni, posizionare lo scivolo su un microscopio ad illuminazione strutturata dotato di un obiettivo di olio 100X e concentrarsi sulle microsfere fluorescenti da 100 nanometri.
Regolare l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino a ottenere una funzione di diffusione del punto simmetrico per ridurre al minimo la sfocatura delle immagini e selezionare un campo visivo con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una regolazione della messa a fuoco di griglia per le lunghezze d'onda di eccitazione designate, in questo caso 561 e 488 nanometri, come guida per il software di analisi delle immagini prima di concentrarsi sulle spore con la luce di trasmissione. Cattura un'immagine della luce di trasmissione in modalità media 16x con esposizioni di 20 millisecondi per ogni immagine.
Quindi, cattura immagini fluorescenti grezze al microscopio ad illuminazione strutturata in 3D delle spore con la modalità di illuminazione 3D-SIM. Per la ricostruzione delle sezioni, fate clic su Param nel foglio di tabulazione del pad di illuminazione strutturata per aprire la finestra Ricostruzione fetta N-SIM. Seguire le istruzioni suggerite e fare clic sui controlli appropriati per impostare il contrasto di modulazione dell'illuminazione sull'auto, la soppressione del rumore ad alta risoluzione su uno e la soppressione della sfocatura fuori dalla messa a fuoco su 0,05 come punti di partenza.
Quindi, fare clic su Ricostruisci sezione per ricostruire l'immagine e valutare la qualità delle immagini ricostruite dalle immagini veloci trasformate da Fourier e dal punteggio di ricostruzione visualizzato dopo la ricostruzione. Regolare il rumore ad alta risoluzione da 0,1 a cinque e l'eliminazione dalla sfocatura della messa a fuoco da 0,01 a 0,5 fino a ottenere le migliori impostazioni dei parametri. Quindi, fare clic su Applica per applicare le modifiche.
Fare clic su Chiudi per chiudere la finestra. Aprire un'immagine grezza delle spore PS4-64 macchiate FM4-64. Quindi, fare clic su Ricostruisci sezione per eseguire la ricostruzione della sezione e salvare l'immagine ricostruita.
Per convertire le immagini grezze 3D-SIM del geminosome KGB80 in immagini pseudo-widefield, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul plug-in ImageJ SIMcheck e selezionare Raw Data SI e Pseudo Widefield. Selezionare casualmente circa 25 spore in ogni immagine di trasmissione invertita per una successiva analisi germinosoma nelle immagini fluorescenti pseudo-widefield fino a quando non sono state selezionate circa 350 spore. Quindi, utilizzare ImageJ per valutare l'intensità massima per ogni segnale fluorescente espresso da ogni gruppo di spore e l'intensità integrata di ogni immagine spora 3D.
Per analizzare le immagini pseudo-widefield del germinosoma KGB80, utilizzare il valore di intensità integrato medio di sette pile come intensità del segnale integrato della spora KGB80. Quindi, determinare le intensità di fondo imaging del ceppo di fondo PS4150 utilizzando impostazioni identiche e considerare le macchie fluorescenti nelle singole spore KGB80 come focolai germinososi quando sono chiaramente distinguibili dallo sfondo. In questo esperimento rappresentativo, due fuochi delle spore fluorescenti GerD-GFP apparvero in diverse pile con tre focolai totali di GerD-GFP osservati nella pila Z3 compositiva.
Qui, è stata osservata una spora con un solo punto focale GerD-GFP nella spora. In totale, circa il 40-50% delle spore aveva rispettivamente due o uno cluster GerD-GFP e GerKB-mCherry. Mentre l'intensità integrata della proteina dell'impalcatura GerD-GFP era diversa tra diverse popolazioni, l'intensità integrata di GerKB-mCherry era all'incazzata in popolazioni diverse.
Quando la spora aveva focolai multipli, l'intensità massima di fluorescenza dei focolai GerD-GFP e GerKB-mCherry tendeva a diminuire, e la fluorescenza massima di tutti i punti luminosi, considerati come focolai germinosomi, era superiore alla massima autofluorescenza delle spore PS4150. In particolare, macchie FM4-64 più luminose simili ai focolai germinosomi compaiono sia nelle spore PS4150 intatte che decocate, suggerendo che queste macchie FM4-64 più luminose potrebbero essere coinvolte nel raggruppamento di proteine germinosoma nella membrana interna. L'aggiunta di spore all'agarosio e il posizionamento dell'agarosio nel telaio richiedono un movimento fluido continuo e attento per questi materiali minis.
La conversione di immagini grezze 3D-SIM del germinosoma KGB80 in immagini pseudo-widefield e la loro interpretazione richiede conoscenze specialistiche sulla biologia delle spore. La nostra procedura di microscopia ad illuminazione strutturata può essere applicata all'imaging di proteine a bassa abbondanza o reporter a fluorescenza fioca in diversi batteri o altri materiali a banda. L'organizzazione del germinosoma può ora essere studiata utilizzando procedure di doppia etichettatura per valutare la co-localizzazione delle proteine germinali del Bacillus e di specifici domini di membrana.
