على الرغم من أن التوسع هو أحد السمات العالمية والأساسية للأنظمة التنموية ، فإن الآليات الأساسية لم يتم فهمها في العديد من الأعضاء والأنسجة. تقنية الحد من حجم حمار وحشي المعروضة في هذا الفيديو سوف تقدم فهمك للآليات الكامنة في عمليات التحجيم الديناميكية. مزايا العمل مع حمار وحشي هو أنه من السهل إجراء التصوير الحي، وعلم الوراثة، والتحليل الكمي.
أسلوبنا هو أيضا بسيطة جدا وسهلة لتطبيقها دون أي معدات متخصصة أو التدريب المكثف. صحة الأجنة هي مفتاح النجاح مع هذه التقنية. استخدام الأسماك الصغيرة كوالدين، وتوخي الحذر لتقليل الضرر عن طريق إزالة chorions.
وأيضا اللعب حولها في حجم الجرح على صفار، وكيف يتم إزالة العديد من الخلايا. وبما أن الأجنة التي نستخدمها صغيرة جداً وهشة، فإنها تحتاج إلى التعامل معها بعناية فائقة عند نقلها وتقطيعها. في الوقت نفسه، فإنه يحتاج إلى أن تكون سريعة بحيث يمكن أن يتم الإجراء في نافذة الوقت الصحيح للتنمية.
يمكن أن يعطي العرض المرئي إحساسًا جيدًا بكيفية إنتاج أجنة أصغر بشكل فعال. لجعل حلقة سلكية لتقطيع الأجنة، تغذية 20 سنتيمتر طويلة قاسية وغير قابلة للتآكل أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال شعري زجاجي، مما يجعل صغيرة، حلقة ملليمتر واحد طويلة في الجزء العلوي. ضع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر واضحة على طرف الشعرية فئة، بين الشعرية وحلقة الأسلاك لعقد ذلك في مكان، والتأكد من عدم الحصول على أي طلاء الأظافر على جزء حلقة، كما أنه قد يضر الأجنة.
ثم اتركه يجف استخدم شريط المختبر لإرفاق الشعيرات الدموية الزجاجية مع الحلقة على عصا الطعام الخشبية ، تاركة حوالي سنتيمترين ونصف من الشعيرات الدموية الزجاجية تمتد إلى ما وراء عصا الطعام بحيث لا ينغمس جزء عيدان الطعام من الأداة في الماء لاحقًا. في طبق بيتري الزجاج 100 ملليمتر مع ملعقة من البلاستيك، انتشار ما يقرب من 0.5 ملليلتر من 2٪ الميثيل السليلوز بالقرب من مركز القاع رقيقة وبتسمك نحو 0.5 ملليمتر.
صب ما يقرب من 30 ملليلتر من محلول رينجر ثلث إلى جانب الطبق، والسماح لها بالانتشار على بقية الطبق وتغطية السليلوز الميثيل. ضع الأجنة التي تم نزعها من الترميد سابقًا في الخلية 256 إلى مرحلة خلية K واحدة على 2٪ من السليلوز الميثيلي ، مع التأكد من توجيه الأجنة إلى جانبها. لقطع البلاستولا، استخدم حلقة الأسلاك لقطع بالقرب من القطب الحيواني، عمودي على محور نباتي الحيوان وقطع ما يقرب من 30 إلى 40٪ من الخلايا البلاستود.
ثم اضغط بلطف نهايات معا لمساعدة الخلايا المتبقية عصا مرة أخرى. بالنسبة إلى الصفار ، استخدم السلك المركب لصنع جرح صغير بالقرب من القطب النباتي عن طريق خدش غشاء البيض ، مما يؤدي إلى ينضح الصفار لبضع دقائق ، ثم يلتئم. عندما يتوقف صفار ناز بها، واستخدام ماصة لنقل الجنين خارج السليلوز الميثيل في نفس الطبق للانتعاش.
كرر الفسولة وصفار تقطيع لجميع الأجنة، ثم اترك الطبق دون عائق لمدة 30 دقيقة بينما تتعافى الأجنة. ثم، استخدم ماصة زجاجية لنقل الأجنة إلى الطبق الزجاجي الذي تم إعداده مسبقًا 35 ملليمترًا ويحتوي على محلول Ringer الطازج من الثلث ووضعها في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح بالتعافي الكامل قبل الاستمرار في التصوير. بعد إجراء قطعت خطوتين مع الفقار وصفار، أظهرت الأجنة على ما يبدو المورفولوجيا العامة الطبيعية طوال مراحل النمو مقارنة بالأجنة التحكم، بخلاف الفرق في الحجم.
من ناحية أخرى، أظهرت الأجنة المفرومة التي لا تقتصر على الأرومة وجود مورفولوجيا غريبة، خاصة في المراحل السابقة. خلال إبيبول، كان الأجنة مظهر ضيق ومسافات بادئة. وفي مرحلة الوسميت التالية، تبين أن هياكل خط الوسط قد سويت بالأرض على مستويات محورية عديدة.
في مراحل لاحقة، هياكل الجسم المجاورة للرفار، مثل منتصف و hindbrain لا تزال تظهر شكل بالارض نسبيا، وربما بسبب زيادة التوتر من صفار أكبر نسبيا. أظهر التصوير الزمني للانهيار لتكوين السومت أنه في كل من الأجنة المتحكمة والمقطّعة، كانت أحجام السومت التي تشكلت في مراحل لاحقة أصغر مقارنة بأحجامها من المراحل السابقة. أيضا، طوال مراحل تكوين السوم، كان الأجنة المفرومة somites أصغر من تلك الموجودة في الأجنة السيطرة.
عندما تم تنفيذ تقنية التقطيع خطوتين على غشاء mCherry حقن الأجنة، والتصوير من الحبال الشوكية في 20 ساعة بعد الإخصاب أظهرت انخفاض في ارتفاعات الأنبوب العصبي بسبب انخفاض الحجم. من المهم جداً أن تحصل على أجنة أصغر حجماً ولكن طبيعية مع كفاءة عالية. من المهم أن نتذكر عدم تقطيع صفار بينما قطع الخلايا من البلاستولا.
بالنسبة للر صفار ، جعل جرح صغير على ذلك للمحتوى لزهو بها. وسوف غشاء صفار تلتئم بشكل طبيعي في المخزن المؤقت السليم. لأنه يمكن استرداد الأجنة المفرومة بسرعة، يمكن تطبيق أي طرق أو تحليل على الأجنة الطبيعية بعد طريقة تقليل الحجم.
بساطة وبراعة هذه التقنية قوية جداً حيث يمكن لأي شخص أن يقدم هذه التقنية لدراسة مشكلة التحجيم في أي نسيج أو عضو في سمك الحمار الوحشي. ونحن نعتقد مع هذه التقنية يمكن للباحثين معالجة مشاكل التحجيم في مجموعة متنوعة من النظم التي لم تمس من قبل. لقد حققنا بالفعل اكتشافات مهمة في توسيع نقش السكومية والانابيب العصبية.
