Sebbene il ridimensionamento sia uno degli attributi universali e fondamentali dei sistemi di sviluppo, i meccanismi sottostanti non sono stati compresi in molti organi e tessuti. La tecnica di riduzione delle dimensioni di zebrafish presentata in questo video farà progredire la comprensione dei meccanismi alla base dei processi di ridimensionamento dinamico. I vantaggi di lavorare con il pesce zebra sono che è facile eseguire immagini dal vivo, genetica e analisi quantitative.
La nostra tecnica è anche molto semplice e facile da applicare senza attrezzature specializzate o allenamento intensivo. La salute degli embrioni è la chiave del successo con questa tecnica. Usa i pesci giovani come genitori e fai attenzione a ridurre al minimo i danni rimuovendo i coriandoli.
E anche giocare nelle dimensioni della ferita sul tuorlo, e quante cellule vengono rimosse. Poiché gli embrioni che utilizziamo sono molto giovani e fragili, devono essere maneggiati con molta attenzione durante il trasferimento e il taglio. Allo stesso tempo, deve essere veloce in modo che la procedura possa essere eseguita nel giusto lando di sviluppo.
La dimostrazione visiva può dare un buon senso a come produrre embrioni più piccoli in modo efficace. Per realizzare un anello metallico per il taglio dell'embrione, alimentare un filo di acciaio inossidabile rigido e non corrosivo lungo 20 centimetri attraverso un capillare di vetro, facendo un piccolo anello lungo un millimetro nella parte superiore. Posizionare una piccola goccia di smalto chiaro sulla punta del capillare di classe, tra il capillare e l'anello del filo per tenerlo in posizione, assicurandosi di non ottenere smalto sulla porzione di loop, in quanto potrebbe danneggiare gli embrioni.
E poi lasciarlo asciugare. Utilizzare il nastro da laboratorio per attaccare il capillare di vetro con l'anello su una bacchetta di legno, lasciando circa due centimetri e mezzo del capillare di vetro che si estende oltre la bacchetta in modo che la parte della bacchetta dell'utensile non si tuffi in acqua in seguito. In una piastra di Petri in vetro da 100 millimetri con spatola di plastica, stendere circa 0,5 millilitri di cellulosa metile al 2% vicino al centro del fondo in modo sottile e uniforme a uno spessore di circa 0,5 millimetri.
Versare circa 30 millilitri della soluzione di Ringer di un terzo sul lato del piatto e lasciare che si diffonda sul resto del piatto e coprire la cellulosa metile. Posizionare embrioni precedentemente de-colinonati allo stadio di cellule da 256 a una K sullo stadio del 2%metilcellulosa, assicurandosi che gli embrioni siano orientati su un lato. Per tagliare la blastula, utilizzare l'anello di filo per tagliare vicino al polo animale, perpendicolarmente all'asse vegetale animale e tagliare circa il 30-40% delle cellule blastoderma.
Quindi toccare delicatamente le estremità insieme per aiutare le cellule rimanenti a tornare indietro. Per il tuorlo, utilizzare il filo montato per fare una piccola ferita vicino al polo vegetale rubando la membrana dell'uovo, che farà trasliare il tuorlo per alcuni minuti, quindi guarire. Quando il tuorlo smette di trasudare, utilizzare una pipetta per spostare l'embrione al di fuori della cellulosa metile nello stesso piatto per il recupero.
Ripeti blastula e tuorlo tagliando per tutti gli embrioni, quindi lascia il piatto indisturbato per 30 minuti mentre gli embrioni si riprendono. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni nella teglia di vetro da 35 millimetri precedentemente preparata contenente la soluzione ringer fresca di un terzo e posizionarli in un incubatore Celsius di 28,5 gradi per consentire il recupero completo prima di continuare con l'imaging. Dopo aver eseguito un taglio in due fasi con blastula e tuorlo, gli embrioni hanno mostrato una morfologia complessiva apparentemente normale durante gli stadi di sviluppo rispetto agli embrioni di controllo, diversa dalla differenza di dimensioni.
D'altra parte, gli embrioni tritati solo blastula mostravano una morfologia particolare, specialmente nelle fasi precedenti. Durante l'epibolità, gli embrioni avevano un aspetto ristretto e rientrato. Nella fase successiva del somite, le strutture della linea mediana sono state appiattite a molti livelli assiali.
Nelle fasi successive, le strutture del corpo adiacenti al tuorlo, come il cervello medio e posteriore, mostravano ancora una forma relativamente appiattita, probabilmente a causa dell'aumento della tensione dal tuorlo relativamente più grande. L'imaging time lapse della formazione di somite ha mostrato che sia negli embrioni di controllo che in quelli tritati, le dimensioni dei somiti che si sono formati nelle fasi successive erano più piccole rispetto a quelle delle fasi precedenti. Inoltre, durante tutte le fasi di formazione del somite, gli embrioni tritati avevano somiti più piccoli di quelli negli embrioni di controllo.
Quando la tecnica di taglio a due gradini è stata eseguita su embrioni iniettati di membrana mCherry, l'imaging del midollo spinale a 20 ore dopo la fecondazione ha mostrato una riduzione dell'altezza del tubo neurale a causa della riduzione delle dimensioni. Il taglio in due gradini è molto importante per ottenere embrioni più piccoli ma altrimenti normali con alta efficienza. È importante ricordare di non tagliare il tuorlo mentre si tagliano le cellule dalla blastula.
Per il tuorlo, fai una piccola ferita su di esso affinché il contenuto traslochi. E la membrana del tuorlo guarirà naturalmente nel tampone corretto. Poiché gli embrioni tritati possono essere recuperati rapidamente, qualsiasi metodo o analisi può essere applicato a embrioni normali può essere eseguito seguendo il metodo di riduzione delle dimensioni.
La semplicità e la versatilità di questa tecnica è molto potente in quanto chiunque potrebbe introdurre questa tecnica per studiare il problema del ridimensionamento in qualsiasi tessuto o organo in zebrafish. Crediamo che con questa tecnica i ricercatori possano affrontare i problemi di scala in una varietà di sistemi che non sono mai stati toccati prima. Abbiamo già fatto importanti scoperte nel ridimensionamento del somite e del patterning dei tubi neurali.
