Ölçekleme gelişim sistemlerinin evrensel ve temel özelliklerinden biri olmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar birçok organ ve dokuda anlaşılamamıştır. Bu videoda sunulan zebra balığının boyut küçültme tekniği, dinamik ölçekleme süreçlerinin altında yatan mekanizmaları anlamanızı sağlayacaktır. Zebra balıkları ile çalışmanın avantajları canlı görüntüleme, genetik ve kantitatif analiz yapmak kolay olmasıdır.
Tekniğimiz de çok basit ve herhangi bir özel ekipman veya yoğun eğitim olmadan uygulamak kolaydır. Embriyoların sağlığı bu teknikle başarının anahtarıdır. Anne olarak genç balık kullanın ve chorions kaldırarak hasarı en aza indirmek için dikkatli olun.
Ve ayrıca sarısı üzerindeki yaranın boyutunda oynayın, ve kaç hücre çıkarılır. Kullandığımız embriyolar çok genç ve kırılgan olduğundan, transfer ve doğrama yaparken çok dikkatli bir şekilde ele almalısınız. Aynı zamanda, prosedür geliştirme doğru zaman penceresinde yapılabilir, böylece hızlı olması gerekir.
Görsel gösteri nasıl etkili küçük embriyolar üretmek için iyi bir fikir verebilir. Embriyo doğrama için bir tel döngü yapmak için, bir cam kılcal damar ile 20 santimetre uzunluğunda sert ve aşındırıcı olmayan paslanmaz çelik tel beslemek, üst kısmında küçük, bir milimetre uzunluğunda döngü yapma. Sınıf kılcal damar ucuüzerine açık oje küçük bir damlacık yerleştirin, kılcal ve tel döngü arasında yerinde tutmak için, döngü kısmına herhangi bir oje almak için emin olun, bu embriyolar zarar verebilir gibi.
Sonra da kurusun. Cam kılcal damarı tahta bir çubuk üzerine takmak için laboratuvar bandı kullanın, böylece aletin çubuk parçası daha sonra suya daldırma değil, çubuk ötesine uzanan cam kılcal yaklaşık iki buçuk santimetre bırakarak. Plastik bir spatula ile 100 milimetrelik cam Petri çanak, yaklaşık 0.5% metil selüloz% 2 metil selüloz yaklaşık 0.5 mililitre alt merkezi yakınında ince ve eşit olarak yaklaşık 0,5 milimetre kalınlığında yayıldı.
Yemeğin yan tarafına üçte bir Ringer çözeltisi yaklaşık 30 mililitre dökün ve yemeğin geri kalanına yayMak ve metil selüloz kapağı sağlar. Daha önce de-chorionated embriyolar yerleştirin 256 hücre bir K hücre evresine 2% metil selüloz üzerinde, emin embriyolar kendi tarafına yönelik olduğundan emin olun. Blastula doğramak için, hayvan direğine dik hayvan direğine yakın kesmek ve blastoderm hücrelerinin yaklaşık% 30-40 kesmek için tel döngü kullanın.
Ardından, kalan hücrelerin geri kalmasına yardımcı olmak için uçları hafifçe birbirine dokunun. Sarısı için, yumurta zarı nicking tarafından vegetal kutup yakınında küçük bir yara yapmak için monte tel kullanın, hangi sarısı birkaç dakika için dışarı sızmak neden olur, ve sonra iyileşmek. Sarısı dışarı sızma durduğunda, iyileşme için aynı çanak metil selüloz dışında embriyo taşımak için bir pipet kullanın.
Tüm embriyolar için blastula ve sarısı doğrama tekrarlayın ve embriyolar iyileşirken 30 dakika boyunca çanak rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, embriyoları daha önce hazırlanmış 35 milimetrelik cam çanağı taze üçte bir Ringer çözeltisi içeren cam çanağı aktarmak için cam bir pipet kullanın ve görüntülemeye devam etmeden önce tam iyileşme sağlamak için 28,5 derece lik bir kantinde yerleştirin. Blastula ve sarısı ile iki adım doğrama yaptıktan sonra, embriyolar boyut farkı dışında, kontrol embriyoları ile karşılaştırıldığında gelişim aşamalarında görünüşte normal genel morfoloji gösterdi.
Öte yandan, blastula sadece doğranmış embriyolar tuhaf bir morfoloji gösterdi, özellikle erken aşamalarında. Epiboly sırasında, embriyolar dar ve girintili bir görünüme sahipti. Aşağıdaki somite evresinde orta hat yapılarının birçok eksenel düzeyde düzleştirilmiş olduğu bulunmuştur.
Daha sonraki aşamalarda, sarısı bitişik vücut yapıları, orta ve arka beyin gibi hala nispeten düzleştirilmiş bir şekil gösterdi, muhtemelen nispeten daha büyük sarısı artan gerginlik nedeniyle. Somit oluşumunun zaman atlamalı görüntülemesi, hem kontrol hem de doğranmış embriyolarda, daha sonraki evrelerde oluşan somitlerin boyutlarının önceki aşamalara göre daha küçük olduğunu göstermiştir. Ayrıca, somit oluşum aşamaları boyunca, doğranmış embriyolar kontrol embriyoları olanlara göre daha küçük somites vardı.
Membran mCherry enjekte edilen embriyolarda iki adım doğrama tekniği yapıldığında, omuriliklerinin döllenme sonrası 20 saat sonra görüntülenmesi, boyut küçültme nedeniyle nöral tüp yüksekliklerinde azalma göstermiştir. İki adım doğrama çok yüksek verimlilik ile küçük ama aksi takdirde normal embriyolar elde etmek önemlidir. Blastuladan hücreleri keserken sarısını doğramamayı unutmamak önemlidir.
Sarısı için, içeriği dışarı sızmak için üzerinde küçük bir yara yapmak. Ve sarısı membran uygun tampon doğal olarak iyileşir. Doğranmış embriyolar hızlı bir şekilde kurtarılabildiği için, normal embriyolara herhangi bir yöntem veya analiz uygulanabilir.
Bu tekniğin sadeliği ve çok yönlülüğü çok güçlüdür, çünkü herkes zebrabalığındaki herhangi bir doku veya organdaki ölçekleme problemini incelemek için bu tekniği tanıtabilir. Bu teknikle araştırmacıların daha önce el değmemiş çeşitli sistemlerde ölçekleme sorunlarını çözebileceğine inanıyoruz. Biz zaten somit ve nöral tüp desenölçekleme önemli keşifler yaptık.
