Embora o dimensionamento seja um dos atributos universais e fundamentais dos sistemas de desenvolvimento, os mecanismos subjacentes não têm sido compreendidos em muitos órgãos e tecidos. A técnica de redução de tamanho do zebrafish apresentada neste vídeo avançará sua compreensão dos mecanismos subjacentes aos processos dinâmicos de dimensionamento. As vantagens de trabalhar com zebrafish são que é fácil realizar imagens vivas, genética e análise quantitativa.
Nossa técnica também é muito simples e fácil de aplicar sem qualquer equipamento especializado ou treinamento intensivo. A saúde dos embriões é a chave para o sucesso com essa técnica. Use peixes jovens como pais e tenha cuidado para minimizar os danos removendo os acordes.
E também brincar com o tamanho da ferida na gema, e quantas células são removidas. Como os embriões que usamos são muito jovens e frágeis, eles precisam ser manuseados com muito cuidado na transferência e corte. Ao mesmo tempo, precisa ser rápido para que o procedimento possa ser feito na janela de tempo certa de desenvolvimento.
A demonstração visual pode dar uma boa noção de como produzir embriões menores de forma eficaz. Para fazer um laço de arame para cortar embriões, alimente um fio de aço inoxidável rígido e não corrosivo de 20 centímetros através de um capilar de vidro, fazendo uma pequena alça de um milímetro de comprimento no topo. Coloque uma pequena gota de esmalte claro na ponta do capilar de classe, entre o capilar e o laço de arame para mantê-lo no lugar, certificando-se de não colocar nenhum esmalte na porção do laço, pois pode danificar os embriões.
E depois deixe secar. Use fita de laboratório para anexar o capilar de vidro com o laço em um pauzinho de madeira, deixando cerca de dois centímetros e meio do capilar de vidro que se estende além do pauzinho para que a parte do pauzinho da ferramenta não mergulhe na água mais tarde. Em uma placa de Petri de vidro de 100 milímetros com uma espátula de plástico, espalhe aproximadamente 0,5 mililitros de celulose de 2%de metila perto do centro da parte inferior fina e uniformemente até uma espessura de aproximadamente 0,5 milímetros.
Despeje aproximadamente 30 mililitros da solução de um terço ringer para o lado do prato, e deixe-o se espalhar para o resto do prato e cobrir a celulose de metila. Coloque embriões anteriormente descorados na célula 256 para um estágio de célula K em celulose de 2% de metila, certificando-se de que os embriões estão orientados para o lado. Para cortar blastula, use o laço de arame para cortar perto do polo animal, perpendicular ao eixo vegetal animal e cortar aproximadamente 30 a 40% das células blastoderm.
Em seguida, bata suavemente nas extremidades para ajudar as células restantes a ficar para trás. Para a gema, use o fio montado para fazer uma pequena ferida perto do polo vegetal cortando a membrana do ovo, o que fará com que a gema escorrer por alguns minutos, e depois curar. Quando a gema parar de escorrer, use uma pipeta para mover o embrião para fora da celulose de metila no mesmo prato para recuperação.
Repita a blastula e a gema cortando para todos os embriões e deixe o prato intacto por 30 minutos enquanto os embriões se recuperam. Em seguida, use uma pipeta de vidro para transferir os embriões para o prato de vidro de 35 milímetros previamente preparado contendo a solução de Ringer de um terço fresco e colocá-los em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para permitir a recuperação completa antes de continuar com a imagem. Depois de realizar dois cortes de duas etapas com blastula e gema, os embriões mostraram morfologia global aparentemente normal em todos os estágios de desenvolvimento em comparação com os embriões de controle, além da diferença de tamanho.
Por outro lado, embriões picados somente por blastula mostraram uma morfologia peculiar, especialmente em estágios anteriores. Durante a epiboly, os embriões tinham uma aparência constrito e recuada. No estágio somite seguinte, as estruturas de linha média foram encontradas achatadas em muitos níveis axiais.
Em estágios posteriores, as estruturas corporais adjacentes à gema, como o cérebro médio e traseiro, ainda apresentavam uma forma relativamente achatada, possivelmente devido ao aumento da tensão da gema relativamente maior. A imagem do lapso de tempo da formação de somite mostrou que, tanto no controle quanto nos embriões picados, os tamanhos de somites que foram formados em estágios posteriores foram menores em comparação com os de estágios anteriores. Além disso, ao longo dos estágios de formação de somite, os embriões picados tinham somitas menores do que os embriões de controle.
Quando a técnica de corte de duas etapas foi realizada em embriões injetados por membrana mCherry, a imagem de suas medulas espinhais em 20 horas após a fertilização mostrou redução nas alturas dos tubos neurais devido à redução de tamanho. Dois passos de corte é muito importante para obter embriões menores, mas de outra forma normais com alta eficiência. É importante lembrar de não cortar a gema enquanto corta as células da blastula.
Para a gema, faça uma pequena ferida sobre ela para o conteúdo escorrer. E a membrana da gema vai curar naturalmente no buffer adequado. Como os embriões picados podem ser recuperados rapidamente, qualquer método ou análise pode ser aplicado a embriões normais pode ser realizado seguindo o método de redução de tamanho.
A simplicidade e versatilidade dessa técnica é muito poderosa, pois qualquer um poderia introduzir essa técnica para estudar o problema de dimensionamento em qualquer tecido ou órgão em zebrafish. Acreditamos que com essa técnica os pesquisadores podem enfrentar problemas de dimensionamento em uma variedade de sistemas que já foram intocados antes. Já fizemos descobertas importantes no dimensionamento da fuligem e da padronização do tubo neural.
