نحن مدينون لمرفق جامعة ولاية يوتا الزرد لتربية المواشي. وأيد من قبل المعاهد الوطنية للصحة RID R56NS053897، وكان LKB متدرب دكتوراه مسبقا بدعم من مبادرة HHMI ميد حيز غراد.

وأثيرت الزرد وتربيتها وفقا للاجراءات المتبعة؛ تمت الموافقة على التجارب من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية ولاية يوتا. 1. إعداد لوحات جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل لوحات الجراحة باستخدام 60 مم أطباق بتري وSylgard 184 السيليكون المرنة كيت، بعد تعليمات الشركة الصانعة. ملء أطباق لا يزيد عن نصف كامل والسماح لبلمرة. متجر تغطيتها على درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 2. إعداد بال micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال بال micropipettes عن طريق تسخين وسحب رقيقة الجدار البورسليكات الشعرية أنابيب في مجتذب micropipette باستخدام نفس إعدادات لصنع إبر حقن مكروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، والمفاجئة قبالة غيض من micropipette إلى ما يقرب من 200 ميكرون في القطر بالملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطبة الحافة المكسورة مع microgrinder في البداية إلى 35 درجة، تليها الميلا الثاني عند 25 درجة. ضمان طرف حاد وSMOالغير. متجر الانتهاء micropipette مشطوف في طبق بتري على كمية صغيرة من الطين. </li></ol> 3. إعداد الزرد اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 أيام قبل الجراحة، وإنشاء خزانات التزاوج من الزرد الذكور والإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة في صباح اليوم التالي، 3 ساعة بعد تتسلط الأضواء على لضمان أقصى قدر من العائد. في حالة استخدام خط مراسل المعدلة وراثيا مثل تيراغرام (elevl3: EGFP) knu3 والأجنة المخصبة نوع 100/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية. إذا باستخدام wildtype، المخصبة نوع الأجنة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام خط مراسل، وشاشة الأجنة للتعبير الفلورسنت في 48 HPF. تسمح الأجنة التي تم تحديدها لتنضج في كثافة 25/100 مم لوحة في 25 مل من E3 في 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما اليرقات هي 5 DPF، وإعداد لوحة لعملية جراحية من خلال تغطية Sylgard مع E2 + 10 ملغم / لتر جنتاميسين سلفات (GS) + تريكين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق الانتعاش بإضافة 25 مل E2 + GS إلى 100 ملم ديس بيتريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مشرط عن طريق تسجيل ثلاث مسحات معا. وهذه تشكل أداة الثلاثي مع ثلاثة أخاديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شن micropipette أعدت على مسحات عن طريق تسجيل ذلك في واحدة من الأخاديد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا إعادة استخدام بال micropipettes، دافق حتى واضح مع E2 + GS باستخدام حقنة 1ML و27 G إبرة قبل المتزايدة على مسحات. </li></ol> 4. جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 1 لوحة من اليرقات في كل مرة (25 الأسماك) مع تريكين. يتم تخدير الأسماك بما فيه الكفاية عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. من المهم أن الأسماك هي تخدير تماما قبل الجراحة، وإلا فإنها سوف نشل عندما مشرط مسها. يتم إجراء الجراحة تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات لوحة الجراحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الأقصى التكبير، وتناوب يرقة واحدة في وقت واحد بحيث انها تقع على جانبها مع عودتها الأقرب إلى يد تمسك مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف ملقط بحيث ترتكز على Sylgard،الزاوية أكثر من عرض من اليرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستعد مشرط الزجاج ضد واحدة من الأسلحة من ملقط، وقطع في الوجه الظهري الجانبي لليرقة على مستوى المسام الشرج، ويجري التأكد من عدم قطع ما وراء حافة بطني من الحبل الظهري. تحريف مشرط لقطع الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر مع اليرقات المتبقية. ملاحظة: إذا ينزف يرقة، فإنه لن يتعافى من عملية جراحية. على الفور إزالة اليرقة من لوحة الجراحة والموت ببطء ذلك عبر تريكين جرعة زائدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة لعملية جراحية على دفعة من اليرقات كاملة، ونقل الجرحى الحيوانات لوحة الانتعاش. هذا هو لدعم تبادل المعلومات من التخدير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحذير: عند جمع اليرقات لنقل المصابين، تأكد من أنها جمعت الرأس أو الذيل الأول: لا تشدد على موقع الإصابة عن طريق الانحناء اليرقات. ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها جميع الأجهزة المستخدمة لإجراء عملية جراحية، بما في ذلك بال micropipettes. </li></ol></li></ol> 5. استعادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آرأصيب ansfer اليرقات من لوحة الاسترداد إلى 100 ملم لوحات مليئة 25 مل E2 + GS في كثافة 25/plate. السماح لاسترداد في حاضنة 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق لوحات اليومية، وإزالة الحيوانات المريضة والنافقة. لا تتغير وسائل الإعلام حتى Coleps (البروتوزوا المياه العذبة) واضحة في وسائل الإعلام. عند تغيير وسائل الإعلام، لا نقل الأسماك إلى لوحة جديدة؛ بدلا من ذلك، إزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان والفيضانات نفس اللوحة مع وسائل الإعلام الجديدة. كرر حسب الضرورة للحد من السكان Coleps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية يومية مع كمية صغيرة من مسحوق يرقات الغذاء. ملاحظة: الغذاء لايف (على سبيل المثال، أو باراميسيا الروتيفر) لا يمكن تغذية اليرقات على المصاب إلا بعد أن تعافى الحركة. خلاف ذلك، فإن الأغذية الحية استعمار موقع الإصابة وتقتل اليرقات. </li></ol>

<ol>
	<li>Houweling, D. A., B&#228;r, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury:+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair.">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li><li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem/progenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery.">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li><li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+regeneration:+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms.">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li><li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish.">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li><li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish.">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li><li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord.">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li><li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li><li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish.">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li><li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish.">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish.">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li><li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repressor+activity+of+Headless/Tcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation.">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

عندما تعلم هذه التقنية في البداية، ونحن نوصي محاولة لا أكثر من 50-100 transections في جلسة واحدة. بعد اتقان هذه التقنية، ونحن قادرون على القطع يصل إلى 300 الأجنة في ساعة؛ ومع ذلك، فإن هذا المستوى من الإنتاجية يتطلب بضعة أشهر من الممارسة الأسبوعية. نوصي أيضا ممارسة مع خط مراسل وا...

الصدمة الكبرى إلى الحبل الشوكي الإنسان غالبا ما يؤدي إلى الشلل الدائم وفقدان الإحساس دون مستوى الإصابة، وذلك بسبب عدم القدرة على محاور عصبية أو تجديد أعماله تنمو الخلايا العصبية 1،2. وعلى النقيض من الثدييات، ومع ذلك، بما في ذلك anamniotes السلمندر والزرد (دانيو rerio) تظهر انتعاشا قويا حتى بعد transection الحبل الشوكي كاملة 3،4. الزرد الكبار هو نموذج راسخة لدراسة عملية الانتعاش في أعقاب إصابة الحبل الشوكي 5-7. التالية transection كاملة في النخاع الشوكي، لوحظ إعادة وظيفة الحسية وقاطرة في الزرد الكبار بنسبة 6 أسابيع بعد الإصابة 8. من أجل دراسة عملية التجدد في الجسم الحي، لجأنا إلى الزرد اليرقات شفافة 9. ونحن هنا نقدم وسيلة لالقطع في الحبل الشوكي من 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) اليرقات الزرد باليودنانوغرام ماصة حقن مكروي مشطوف كما مشرط أو تعديلها من بهات، وآخرون. يدعم 10 هذا الأسلوب إنتاجية عالية ومعدلات وفيات منخفضة، والتكاثر. مع الممارسة، 300 يرقة / ساعة يمكن مقطوع، وأكثر من 6 أشهر من transections، بما في ذلك أكثر من 3،600 الحيوانات، 98.75٪ ± 0.72٪ نجا حتى 7 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة). وتظهر بيانات لدينا انتعاش سريع للتنقل الحسية وكذلك: في 1 نقطة في البوصة، هو الدافع وراء كل حركة من الأسماك أصيب الصدرية تحرك الزعانف فقط. ومع ذلك، تبدأ اليرقات للرد على إبرة التنغستن مسة الذيلية لtransection بنسبة 2 نقطة في البوصة، إعادة تأسيس الحركة C-منحنى بنسبة 3 نقطة في البوصة، وعرض السباحة المفترسة بنسبة 5 نقطة في البوصة 11. باستخدام الأجسام المضادة ضد تلطيخ تويولين الأسيتيل، ونحن قد أكدت أن محاور هي غائبة عن موقع الإصابة في 1 نقطة في البوصة، ولكن عبروا موقع الإصابة بنسبة 5 نقطة في البوصة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول توفير تقنية قيمة لدراسة إعادة نمو محور عصبي وتكوين الخلايا العصبية في النخاع الشوكي بعد الاصابة. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="733">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">60mm petri dish</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">100mm petri dish</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9644388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm</td>
			<td style="width:179px;">Warner Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">64-0778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">forceps</td>
			<td style="width:179px;">Fine Scientific Tools Inc.</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">disssection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ6454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microgrinder</td>
			<td style="width:179px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Amresco Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0304-5G</td>
			<td>dissolve in water 10mg/ml, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tricaine</td>
			<td style="width:179px;">Acros Organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">118000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">cotton tipped applicator, wood, 6-inch</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">27 ga. needle</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fry food</td>
			<td style="width:179px;">Argent Labs</td>
			<td style="width:119px;">F-ARGE-PTL-CN</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Box Filament FB330B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">20x E2 (1L)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">17.5g NaCl</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.75g KCl</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">2.90g CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td style="width:179px;">Sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">4.90g MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">MX0070-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.41g KH2PO4</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.12g Na2HPO4</td>
			<td style="width:179px;">Sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S0876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">500x NaCO3 (10ml)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>make fresh, discard extra</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">0.35g NaCO3</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">1x E2 (1L)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">50ml 20x E2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">2ml fresh 500x NaCO3</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord transection in the larval zebrafish

تفشل الثدييات في الانتعاش الحسية والحركية التالية إصابة النخاع الشوكي بسبب نقص إعادة نمو محور عصبي دون مستوى الإصابة وكذلك عدم القدرة على معاودة تكوين الخلايا العصبية في العمود الفقري. ومع ذلك، فإن بعض anamniotes بما في ذلك الزرد دانيو rerio المعرض على حد سواء الحسية والانتعاش وظيفية حتى بعد transection كاملة من الحبل الشوكي. الزرد الكبار هو نموذج حي أنشئت لدراسة التجديد التالية اصابات الحبل الشوكي، مع الانتعاش الحسية والحركية من خلال 6 أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الجسم الحي في تحليل عملية التجدد المتاحة في الزرد اليرقات شفافة وكذلك الأدوات الجينية لا يمكن الوصول إليها في الكبار، ونحن نستخدم اليرقات الزرد لدراسة تجديد بعد transection الحبل الشوكي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لبتكاثر ويمكن التحقق منه transecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، بياناتنا تظهر الانتعاش الحسية بداية في 2 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة)، وخفة دمح حركة-C منحنى كشفها بواسطة 3 نقطة في البوصة واستئناف السباحة الحرة بنسبة 5 نقطة في البوصة. وبالتالي نقترح الزرد اليرقات كأداة مصاحب لالزرد الكبار لدراسة الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي.

للحد من شدة تلف الأنسجة المحيطة بموقع الإصابة، الميلا السليم من micropipette أمر بالغ الأهمية. ويبين الشكل 1A تلميح مشطوف بشكل صحيح. باستخدام تلميح بأن واسعة جدا (1B الشكل) يميل إلى نتيجة في عدد القتلى أعلى نظرا لاحتمال زيادة الخدش الأبهر الظهري، في حين أن ا...

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish at JoVE.com

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بعد الإصابة، وحركة C-منحنى قبل 3 أيام بعد الإصابة.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Views.  University of Utah.  بعد transection الشوكي، الزرد الكبار يكون الانتعاش وظيفية لمدة ستة أسابيع بعد الإصابة. للاستفادة من الشفافية اليرقات والانتعاش بشكل أسرع، ونحن نقدم وسيلة لtransecting الحبل الشوكي اليرقات. بعد transection، نلاحظ الانتعاش الحسية ابتداء من الساعة 2 أيام بع...

Video: Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

الدماغ الأمامي تسجيل الكهربية في الزرد اليرقات

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في اليرقات البحر الجلكى

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

التصوير نشر في الحبل الشوكي الجرذ عنق الرحم

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...